分子生物學(xué)講座ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-30 18:09 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 RNA信息的 cDNA克隆集合稱(chēng)為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)?；蚪M含有的基因在特定的組織細(xì)胞中只有一部分表達(dá)，而且處在不同環(huán)境條件、不同分化時(shí)期的細(xì)胞其基因表達(dá)的種類(lèi)和強(qiáng)度也不盡相同，所以 cDNA文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。 cDNA文庫(kù)顯然比基因組 DNA文庫(kù)小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得細(xì)胞特異表達(dá)的基因。但對(duì)真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從基因組 DNA文庫(kù)獲得的基因與從 cDNA文庫(kù)獲得的不同，基因組 DNA文庫(kù)所含的是帶有含子和外顯子的基因組基因，而從 cDNA文庫(kù)中獲得的是已經(jīng)過(guò)剪接、去除了內(nèi)含子的 cDNA。（ 3）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） 如果已經(jīng)知道目的基因的序列，就能很方便地用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ polymerase chain reaction， PCR）， 從基因組 DNA或 cDNA中獲得目的基因，可不必要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的 DNA文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程。 PCR反應(yīng)系統(tǒng)包括：168。 含有目的基因的 DNA模板168。 對(duì)熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶168。 一對(duì)寡核苷酸引物168。 4種三磷酸脫氧核苷168。 保證聚合酶催化反應(yīng)的緩沖液（ 4）人工化學(xué)合成現(xiàn)在計(jì)算機(jī)控制的全自動(dòng)核酸合成儀已被廣泛應(yīng)用，按人們?cè)O(shè)計(jì)好的序列一次合成 100200bp長(zhǎng)的 DNA片段已不成問(wèn)題。但隨意合成的 DNA絕大多數(shù)肯定不具有生物功能或無(wú)法知道它會(huì)有什么功能的，因而只能模仿自然界生物中已知的基因序列來(lái)合成，而化學(xué)合成這樣長(zhǎng)的基因 DNA序列，其價(jià)格遠(yuǎn)高于用 PCR法獲得基因，所以目前很少全部用化學(xué)方法去合成基因。但人工設(shè)計(jì)化學(xué)合成核酸片段作為引物、接頭等已經(jīng)成為分子生物學(xué)和基因工程中必不可少而且十分重要的手段 。第四節(jié) 目的基因和載體的連接 將目的基因或序列插入載體，主要靠 DNA連接酶。有以下主要的方式。一、粘性末端連接 如果目的序列兩端有與載體上相同的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，則同一限制酶切開(kāi)產(chǎn)生的粘末端，在降低溫度退火時(shí)，能重新互補(bǔ)結(jié)合，在DNA連接酶催化下，目的序列就與載體 DNA鏈相連接。 不同的限制性?xún)?nèi)切酶切，如果產(chǎn)生的 DNA的粘末端相同（同尾酶），也可用此法連接。 如果在連接的兩個(gè) DNA片段沒(méi)有能互補(bǔ)的粘性末端，可用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化脫氧單核苷酸添加 DNA的 3’末端，例如一股 DNA3’端加上 polyG， 另一股 DNA3’端 加上 polyC， 人工在 DNA兩端做出能互補(bǔ)的核苷酸多聚物粘性末端，退火后能連接，稱(chēng)為同聚物加尾法。 對(duì)平末端的 DNA， 可先連上人工設(shè)計(jì)合成的脫氧寡核苷酸雙鏈接頭，使 DNA末端產(chǎn)生新的限制內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)內(nèi)切酶割后，即可按粘性末端相連。 GGGGGC
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