【文章內(nèi)容簡介】 ETTM 和AttractorsTM軟件就屬于集群分析軟件。該軟件的特點是會隨著整個細胞亞群的移動而移動，自動變換區(qū)域或邊界到相應的細胞亞群位置（見圖510）。 圖510 使用Attractors分析軟件時二維點圖的前后變化對比 流式細胞儀的其它應用以及數(shù)據(jù)分析 這些分析方法通常適用于計算離散細胞群的百分含量，對于分析單克隆細胞株分子是否呈陽性并不適用。因為單克隆細胞株是單個細胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統(tǒng)計細胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統(tǒng)計結果遠遠大于陰性對照組，那么我們認為其結果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細胞的表達越高，陽性率越高。 如圖511所示，左圖為單細胞群的散射光信號，右圖為陰性對照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個峰的幾何均值分別為2，5和20（從左至右）。圖511 單細胞株分析圖 除檢測陽性率，幾何均值法和中位法還用于分子（接合子）定量分析。QuantiCALCTM軟件就是使用中值法計算每個細胞的抗體結合位點數(shù)。如圖512所示，Y軸上的圓圈代表從標準曲線獲取的信息，用于計算每個細胞的接合點位數(shù)。 圖512 使用QuantiCALC軟件計算每個細胞的抗體結合位點數(shù) 我們使用ModFit LTTM軟件進行DNA定量分析。因為DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是離散的，所以我們對曲線以下的面積進行積分，以得到每個細胞亞群的百分含量結果。 圖513 細胞周期的DNA直方圖 習題：數(shù)據(jù)分析 1二維點圖和一維直方圖的作用分別是什么？ 2 見圖54和圖55，CD3陰性和陽性的百分含量分別是多少。 3 LL象限代表雙陽性細胞亞群。（對 錯） 4 見圖56和圖57，淋巴細胞（CD3+/CD19）的百分含量是多少。 5 只能使用矩形設定細胞區(qū)域范圍。（對 錯） 6 使用區(qū)域設定法分析樣本有哪些不足。 7 避免細胞亞群移動的分析方法是什么。 8 在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測陽性率。 CellQuest和CellQuest Pro軟件使用 CellQuest和CellQuest Pro軟件是目前運用最為廣泛的流式細胞儀采集及分析軟件。它運行于蘋果電腦上，優(yōu)質(zhì)的矢量圖顯示使得操作界面特別優(yōu)美?，F(xiàn)最新的微軟公司的Vista軟件也是仿蘋果操作系統(tǒng)界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro時的強大功能及視覺質(zhì)感。CellQuest和CellQuest Pro軟件主安裝在BD FACSCalibur型流式細胞儀上。1．軟件數(shù)據(jù)流程 在CellQuest和CellQuest Pro軟件的數(shù)據(jù)流分為二個部分：方案和數(shù)據(jù)包。方案是指用戶可以建立采集或分析所需的直方圖或散點圖、設門并定義門與門、門與圖之間的邏輯關系?？梢允褂梅桨高M行數(shù)據(jù)采集或分析以往已有的數(shù)據(jù)。每個采集方案分析樣本后會生成數(shù)據(jù)包，該數(shù)據(jù)包中包括了樣本中每個顆粒在各個檢測參數(shù)上的數(shù)值。CellQuest和CellQuest Pro方案文件的圖標CellQuest和CellQuest Pro數(shù)據(jù)文件的圖標CellQuest和CellQuest Pro軟件中還會有關于儀器設置的文件，保存所有的實驗條件。它只能由CellQuest和CellQuest Pro軟件打開。數(shù)據(jù)包必須由方案文件打開，無法單獨顯示，或者可由第三方軟件進行分析，如WinMDI。 流式細胞儀需要加電開啟后會向計算機發(fā)出信息，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然后再開啟計算機。 先開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。 在蘋果菜單下點擊CellQuest和CellQuest Pro軟件。 從Aquire菜單下選擇connet to cytometer。3．方案與數(shù)據(jù)之間的關系CellQuest和CellQuest Pro軟件的方案與數(shù)據(jù)相互獨立保存，數(shù)據(jù)包可以由任一方案文件進行分析，分析后不改變數(shù)據(jù)包中的任何數(shù)據(jù)。CellQuest和CellQuest Pro軟件中方案內(nèi)的直方圖或散點圖有三種狀態(tài)：Acquire，Analysis和AcquireAnalysis。當圖的屬性為Acquire時，此圖只限于采集下用，即只當進行檢測時它才能顯示顆粒；當圖的屬性為Analysis時，此圖只限于分析已保存的數(shù)據(jù)包，它不能用于采集數(shù)據(jù)。當圖的屬性為AcquireAnalysis時，此圖即可用于采集數(shù)據(jù)也可用于分析已有數(shù)據(jù)。所以方便起見，我們一般將方案中的直方圖或散點圖全部設為AcquireAnalysis屬性。CellQuest Pro CellQuest4．方案的建立A選擇實驗參數(shù)默認情況下，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀開機后只打開一根激光器，及五個參數(shù)供選擇使用：FS、SS、FLFLFL3。當我們要使用第二根激光器及FL4通道時需要勾選FL4的選項，儀器自動打開633nm激光器。選擇Four Color后，儀器自動打開第二根激光器，且此時FL4可用。B,建立散點圖或直方圖，命名坐標CellQuest Pro軟件主要工作界面，軟件類似于Office word的工作面，可在A4大小的頁面上進行編輯建立各種直方圖或散點圖。使用工具條可以建立散點圖、直方圖并在圖上設立各種門。在CellQuest Pro軟件中，如果Inspector窗口開著的話，選中任意直方圖或散點圖就會出現(xiàn)該圖的屬性，其中包括有X、Y軸的參數(shù)、是否多色顯示、圖的分析或采集屬性等等。 在CellQuest軟件下，需在選擇Plot菜單，選擇Format來打開圖的屬性對話框，其中包括了關于該圖所有選項。建立好直方圖或散點圖后，我們需要對所選的參數(shù)進行命名，如不修改軟件自動命名為FS、SS、FLFLFL3和FL4。在菜單上選擇Acquire欄目，選擇Parameter Description，可出現(xiàn)關于文件存儲和參數(shù)命名的對話框。在這個對話框中用P字母來代表每個參數(shù)，并在此對每個采集參數(shù)進行命名，F(xiàn)L1為CD3FITC，F(xiàn)L2為CD4PE……。C,設門并建立門與圖之間的關系在工具欄上有左側(cè)幾個按鈕可分別矩形門、自由門、線性門、圓形門和自動門。本處重點介紹SnapTo門，它可根據(jù)細胞群體的分布自動調(diào)整門的形狀適應細胞群體。R與G的關系R是Region的首個字母，Region一般是指一個閉合形的區(qū)域，如矩形區(qū)、自由區(qū)和圓形區(qū)。區(qū)域與區(qū)域之間可以進行邏輯運算，如AND、OR、NOT等關系。當區(qū)域進行運算時軟件引進了算術公式的管理概念：Gate實際了個代數(shù)式，簡稱G，其運算式默認如下：G1 = R1，或G2=R2當我們要進行邏輯運算時，可變更為G1=R1 AND R2。此時G1就成了一個算術結果了。G1=R1 AND R2G2=R1 NOT R2G3=R1 OR R2Region List管理門，可以重命名或刪除門。Gate List是對門進行邏輯運算和標識顏色的工具。建立門與圖之間的關系打開要編輯的直方圖或散點圖的屬性對話框，選擇Gate選項，選擇門即可。D，顯示統(tǒng)計參數(shù)如何編輯這些統(tǒng)計參數(shù)選擇統(tǒng)計參數(shù)框，在Stats菜單下的Edit Statistic會變得可用，點出后出現(xiàn)統(tǒng)計參數(shù)編輯對話框。選擇任意直方圖或散點圖，在Stats下拉菜單下會有更種統(tǒng)計參數(shù)選項。對應于不同的圖出現(xiàn)不同的統(tǒng)計參數(shù)。5．儀器的操作當計算機與流式細胞儀聯(lián)機后便會出現(xiàn)以下采集控制框：在有關儀器操作所有控制選項框都在Cytometer下拉菜單下，同時按住“蘋果”鍵及4便可調(diào)取所有控制框： 6．文件的保存及調(diào)用實驗或分析過程中所建的方案可以保存下來，通File下拉菜單可以保存這些方案文件：如要打開這些分析方案只需雙建方案圖標即可；方案可以分析以往的數(shù)據(jù)包（前提是方案中的直方圖或散點圖都已定義成AcquireAnalysis屬性），有兩種方案打開以往的數(shù)據(jù)：方法一：選擇直方圖或散點圖，打開該圖的屬性框（PlotFormat），見下圖：在以上紅色框標注的地方選擇要分析的數(shù)據(jù)包。方法二：選中方案中所有的直方圖或散點圖，打開Plots菜單，選擇Chang Data File，打開要分析的數(shù)據(jù)包。附：CellQuest Pro軟件所有下接菜單 MutiSet軟件使用MultiSET是BD公司的一個全自動獲取分析軟件。它使用免洗試劑（TriTEST三色試劑或MultiTEST四色試劑）制備標本，可以用來做外周血的淋巴細胞及亞型分析，同時使用TruCOUTNT,可以進行絕對計數(shù)。MulSET設門分析，用Attractor定出淋巴細胞亞型區(qū)域。Attractor具有自動檢查細胞位置漂移的功能，并自動居中。因此，使用Mul軟件，可以提高實驗室的工作效率和計數(shù)的精確度。1. MultiSET文件生成的文件類型：Schedule Document File (【DDMMYY】．Sch)：日程記錄文件。 Laboratory Report File(【前綴】【輸入號】．Lab)：實驗室報告，PICT文件。Physician Report File(【前綴】【輸入號】．Phy)：醫(yī)生報告，PICT文件。Summary Report File（【DDMMYY】．Sum）：總結報告，PICT文件。 Flow Cytometry Standard（FCS）Data File（【前綴】【輸入號】．【試管編號】）： ..Export Document File(【DDMMYY】．Exp) ：文本文件,包含標本和試劑信息,以及每管的所有亞群結果. 流式細胞儀需要加電開啟后會向計算機發(fā)出信息，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然后再開啟計算機。先開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。在蘋果菜單下點擊MultiSET軟件(或在Dock界面上點擊MultiSET)..2. 進入MultiSET MultiSET命令菜單 參數(shù)預設:● Export Preferences:選擇輸出格式Tab或Comma。選擇報告哪些試驗結果,按Select Values to Export.● Printing Preferences:選擇是否自動打印實驗室報告 Laboratory report,醫(yī)生報告Physician report, 總結報告Summary report.● Pannels Preferences:預先設定試驗項目Run a fixed panel,或任意選定試驗項目Run any panel.● Events Preferences:選擇獲取細胞數(shù)量.● LeveyJennings Preferences:選擇質(zhì)控統(tǒng)計,每30個一統(tǒng)計(30runs),每60個一統(tǒng)計(60runs),或不統(tǒng)計(None)MultiSET運行程序ⅰ Sign In:輸入操作者、單位、實驗室主任,登記進入MultiSET.ⅱ Set Up:建立測試要求.ⅲ FACSComp:運行FACSComp,調(diào)整儀器條件.ⅳ Test Prefs:規(guī)定報告內(nèi)容.ⅴ Samples:輸入標本及病人信息.以下程序自動運行,由MultiSET做提示:ⅵ Acquisition:,以便查看標本獲取情況.ⅶ Analysis:,以便查看自動分析過程.ⅷ Lab Report:做實驗室報告,顯示每個標本的各管結果.ⅸ Phys Report:做醫(yī)生報告,顯示每個標本的結果及正常值范圍.ⅹ Summary:.第一步:Sign In:MultiSET軟件的起始頁.●輸入操作者姓名,.●點擊Accept,進入下一工作程序.第二步: Set Up:建立測試要求●Data Source 選擇數(shù)據(jù)來源.√From Data Files:對以前保存的數(shù)據(jù)文件做分析.√From Cytometer:Acquisition and Analysis:在流式細胞儀上運行標本,獲得數(shù)據(jù)并分析.√From Cytometer:Acquisition Only:在流式細胞儀上運行標本,獲得數(shù)據(jù)不分析.● Entry Level File Name Prefix 確定數(shù)據(jù)文件,實驗室報告,醫(yī)生報告等文件名前綴的使用.● View Reports 選擇讀實驗室報告和醫(yī)生報告的時間.● Automatic Saving Options 確定自動保存的文件類型及保存位置.√選擇是否保存Data Files,Laboratory Report,Physician Report,Summary Report,Export Document.√按Location,選擇文件保存路徑,文件默認路徑BD Files:MultiSET Files:【DDMMYY】Folder(自動生成日期目錄).目錄名確認后,按Select DDMMYY確定,返回Set Up界面.. 第三步: FACSComp:運行FACSComp,調(diào)整儀器條件● 選擇Launch FACSComp,進行Lyse no wash校正.● 如果當日已做校正,則選擇Skip FACSComp,第四步: Test Prefs:規(guī)定報告內(nèi)容