【正文】 件,打開Cytometer→Instrument Settings→Open(FACStation→BD Files→Instrument Settings Files→Calib File● 如果是對(duì)以前檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,點(diǎn)擊Add Sameple,添加數(shù)據(jù),進(jìn)行分析.第六步: Acquisition:,以便查看標(biāo)本獲取情況第七步: Analysis:,以便查看自動(dòng)分析過(guò)程.第八步: Lab Report:做實(shí)驗(yàn)室報(bào)告,顯示每個(gè)標(biāo)本的各管結(jié)果.注:可以點(diǎn)擊Manual Gate,此時(shí)可以更改點(diǎn)圖大小,調(diào)整淋巴細(xì)胞門或Attractors.第九步: Phys Report:做醫(yī)生報(bào)告,顯示每個(gè)標(biāo)本的結(jié)果及正常值范圍.第十步:Summary:. SimulSET軟件使用 HLAB27軟件使用 HLAB27自動(dòng)軟件是BD公司的一個(gè)全自動(dòng)獲取分析軟件。因此，使用Mul軟件，可以提高實(shí)驗(yàn)室的工作效率和計(jì)數(shù)的精確度。選擇任意直方圖或散點(diǎn)圖，在Stats下拉菜單下會(huì)有更種統(tǒng)計(jì)參數(shù)選項(xiàng)。R與G的關(guān)系R是Region的首個(gè)字母，Region一般是指一個(gè)閉合形的區(qū)域，如矩形區(qū)、自由區(qū)和圓形區(qū)。使用工具條可以建立散點(diǎn)圖、直方圖并在圖上設(shè)立各種門。CellQuest和CellQuest Pro軟件中方案內(nèi)的直方圖或散點(diǎn)圖有三種狀態(tài)：Acquire，Analysis和AcquireAnalysis。CellQuest和CellQuest Pro方案文件的圖標(biāo)CellQuest和CellQuest Pro數(shù)據(jù)文件的圖標(biāo)CellQuest和CellQuest Pro軟件中還會(huì)有關(guān)于儀器設(shè)置的文件，保存所有的實(shí)驗(yàn)條件。 CellQuest和CellQuest Pro軟件使用 CellQuest和CellQuest Pro軟件是目前運(yùn)用最為廣泛的流式細(xì)胞儀采集及分析軟件。因?yàn)镈NA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是離散的，所以我們對(duì)曲線以下的面積進(jìn)行積分，以得到每個(gè)細(xì)胞亞群的百分含量結(jié)果。因?yàn)閱慰寺〖?xì)胞株是單個(gè)細(xì)胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽(yáng)性，所以我們通過(guò)幾何均值法和中位法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞熒光密度和陽(yáng)性率。 圖57 散點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果 另一個(gè)分析方法是劃定區(qū)域，也就是設(shè)門。右圖中M2為CD3 FITC陽(yáng)性峰。 圖53 選定淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門 門內(nèi)細(xì)胞的數(shù)據(jù)結(jié)果可在隨后的圖中顯示。 2 二維點(diǎn)圖用于顯示 參數(shù)。 數(shù)據(jù)采集存儲(chǔ)完畢后，細(xì)胞亞群可以幾種不同格式顯示。如果設(shè)置了兩個(gè)閾值，那么粒子必須同時(shí)滿足兩個(gè)閾值的要求才會(huì)被當(dāng)作信號(hào)細(xì)胞處理。 2 敏感度高的 收集SSC光信號(hào)和熒光信號(hào)。 粒子進(jìn)入照射區(qū)開始散射光或熒光時(shí)產(chǎn)生充電脈沖，首先光信號(hào)或光子由光電倍增管（PMTs）或光電二極管轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號(hào)，產(chǎn)生電流，電流經(jīng)由放大器，轉(zhuǎn)換成充電脈沖。大于560nm的波長(zhǎng)被反射。BP 500/50則表示其允許通過(guò)波長(zhǎng)范圍為475nm525nm。 4 在臺(tái)式機(jī)中，固定的 能夠保證激光截取 的位置是不變的。圖41和圖42分別為臺(tái)式機(jī) FACS Calibur 和 BD LSR 的光平臺(tái)系統(tǒng)。 6 流式細(xì)胞儀最常用的兩種熒光素是 和 。8． 每一個(gè)多色分析的實(shí)驗(yàn)，都需要進(jìn)行補(bǔ)償?shù)恼{(diào)整。5． 使用雙色補(bǔ)償質(zhì)控樣本，微調(diào)補(bǔ)償。流式細(xì)胞儀多色分析的補(bǔ)償調(diào)整步驟1． 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室要求，每日做儀器校正（calibration/standardization）。這些光譜的交叉重疊，會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)被相應(yīng)檢測(cè)器以外的錯(cuò)誤的檢測(cè)器探測(cè)到。而且，還可以對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行再分選。這兩種熒光素的發(fā)射光譜如圖34所示。 能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長(zhǎng)范圍稱為激發(fā)光譜。2 光散射信號(hào)與細(xì)胞的哪些特性有關(guān)。散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)（如染色），因此被稱為細(xì)胞的物理特性，即細(xì)胞的大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 5 鞘液環(huán)包樣品并使之居中的過(guò)程稱為 效應(yīng)。當(dāng)液柱變寬時(shí)，一些流經(jīng)激光束的細(xì)胞會(huì)偏離中心，光斑也會(huì)偏離理想角度，這在一定程度下是允許的。 而且在特定時(shí)間內(nèi)，應(yīng)該只有一個(gè)細(xì)胞或粒子通過(guò)激光束。氣壓閥置于加壓位置，待流式細(xì)胞儀處于STANDBY狀態(tài)，做Prime，以排除管路中氣泡。被液滴包繞的粒子稱為細(xì)胞液柱，當(dāng)粒子經(jīng)過(guò)激光照射區(qū)時(shí)，通過(guò)激光激發(fā)產(chǎn)生散射光。液流系統(tǒng)：依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。流式細(xì)胞儀培訓(xùn)手冊(cè)Version 1200922蘇州市躍亞生物技術(shù)有限公司序 論學(xué)習(xí)儀器的最好方法是操作儀器，然而在理解原理的基礎(chǔ)上進(jìn)行儀器操作無(wú)疑會(huì)起到事半功倍的作用。含有熒光的粒子就會(huì)表現(xiàn)出其熒光特性。關(guān)機(jī)程序：（1） 選關(guān)閉計(jì)算機(jī)。 因此，必須在流動(dòng)室內(nèi)把細(xì)胞注入鞘液流。臺(tái)式機(jī)：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出，粒子或細(xì)胞在流動(dòng)室內(nèi)與激光相交（圖21）。 6 什么調(diào)節(jié)器可以控制細(xì)胞液柱的寬窄？ 7 對(duì)于臺(tái)式機(jī)，樣本的固定壓力是多少。散射光與細(xì)胞膜，核膜以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的折射性、顆粒性密切相關(guān)，細(xì)胞形狀和表面形貌也對(duì)其產(chǎn)生影響。 3 與激光束方向相同的光散射稱為 散射。因?yàn)楦嗟哪芰肯脑谖辙D(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長(zhǎng)要高于激發(fā)光波長(zhǎng)。雖然PE的激發(fā)光譜的峰值不是488nm，但也足以檢測(cè)到熒光。 熒光補(bǔ)償使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行多色分析時(shí)，由于熒光發(fā)射光譜的重疊，需要做補(bǔ)償調(diào)整 在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行多色免疫熒光分析時(shí)，使用的不同熒光素的發(fā)射光譜有重疊現(xiàn)象，如果不對(duì)這種現(xiàn)象做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，就會(huì)導(dǎo)致某一熒光素發(fā)出的熒光被其它“錯(cuò)誤”的檢測(cè)器檢測(cè)到。因此，要使用補(bǔ)償?shù)霓k法校正這種信號(hào)重疊導(dǎo)致的錯(cuò)誤。2． 檢測(cè)一個(gè)未染色樣本（自發(fā)熒光），調(diào)整前向角散射光FSC和側(cè)向角散射光SSC設(shè)置，使測(cè)定細(xì)胞群體顯示好，并可以按要求設(shè)門。用①FITC和PE單克隆抗體，②PE和CyChrome單克隆抗體染色，最好使用單克隆抗體和同型對(duì)照染互斥的單陽(yáng)性細(xì)胞群體。因此，每做一種多色分析的實(shí)驗(yàn)，都要用單染和雙染對(duì)照樣本，按照37步做實(shí)驗(yàn)條件的調(diào)整。 7 熒光素標(biāo)記抗體用于檢測(cè) 。 圖41 臺(tái)式機(jī) FACS Calibur 光平臺(tái)系統(tǒng)圖42 臺(tái)式機(jī) BD LSR光平臺(tái)系統(tǒng)在大型機(jī)中，當(dāng)液流流過(guò)噴嘴時(shí)，激光束通過(guò)消色差透鏡組以最佳角度和位置截取液流。 光學(xué)濾片 當(dāng)細(xì)胞或粒子流過(guò)激光照射區(qū)時(shí)，SSC和熒光信號(hào)很弱，需要使用光電倍增管（PMTs）收集，而FSC信號(hào)很強(qiáng)，由光電二極管收集即可。 流式細(xì)胞儀中常用的濾片還有長(zhǎng)通濾片（LP）和短通濾片（SP），長(zhǎng)通濾片使特定波長(zhǎng)以上的光通過(guò)，特定波長(zhǎng)以下的不通過(guò)。圖 44 光線通過(guò)長(zhǎng)通濾片、短通濾片及帶通濾片的波長(zhǎng)范圍 習(xí)題 ：光學(xué)濾片 1 檢測(cè)器前放置濾片作用是什么。當(dāng)粒子位于激光束正中時(shí)，脈沖最大，熒光最強(qiáng)。 3 探測(cè)器產(chǎn)生電流，經(jīng)由放大器轉(zhuǎn)換成電壓。 習(xí)題：閾值 1 FSC閾值用于消除 信號(hào)。單參數(shù)如FSC或FITC（FL1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道。 3 在CellQuest軟件中3維圖中Z軸代表 。在下面的實(shí)例中，我們將詳盡闡述細(xì)胞亞群百分含量的不同分析方法。圖54 陰性對(duì)照峰M1（NORM001）和CD3 FITC陽(yáng)性峰M2（NORM002） 圖55的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，整個(gè)事件共記錄了6000個(gè)細(xì)胞，門內(nèi)淋巴細(xì)胞2891個(gè)。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區(qū)域（如圖58所示）；然后統(tǒng)計(jì)該區(qū)域內(nèi)指定細(xì)胞亞群的百分含量。如果樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陰性對(duì)照組，那么我們認(rèn)為其結(jié)果是陽(yáng)性的，兩者間的差異越大，說(shuō)明細(xì)胞的表達(dá)越高，陽(yáng)性率越高。 圖513 細(xì)胞周期的DNA直方圖 習(xí)題：數(shù)據(jù)分析 1二維點(diǎn)圖和一維直方圖的作用分別是什么？ 2 見圖54和圖55，CD3陰性和陽(yáng)性的百分含量分別是多少。它運(yùn)行于蘋果電腦上，優(yōu)質(zhì)的矢量圖顯示使得操作界面特別優(yōu)美。它只能由CellQuest和CellQuest Pro軟件打開。當(dāng)圖的屬性為Acquire時(shí)，此圖只限于采集下用，即只當(dāng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)它才能顯示顆粒；當(dāng)圖的屬性為Analysis時(shí)，此圖只限于分析已保存的數(shù)據(jù)包，它不能用于采集數(shù)據(jù)。在CellQuest Pro軟件中，如果Inspector窗口開著的話，選中任意直方圖或散點(diǎn)圖就會(huì)出現(xiàn)該圖的屬性，其中包括有X、Y軸的參數(shù)、是否多色顯示、圖的分析或采集屬性等等。區(qū)域與區(qū)域之間可以進(jìn)行邏輯運(yùn)算，如AND、OR、NOT等關(guān)系。對(duì)應(yīng)于不同的圖出現(xiàn)不同的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。1. MultiSET文件生成的文件類型：Schedule Document File (【DDMMYY】．Sch)：日程記錄文件。它是專門用來(lái)分析人類白細(xì)胞抗原B27基因表達(dá)與否。（或者在上次執(zhí)行2色Calibrite beads分析后，直接點(diǎn)擊Set Up進(jìn)入Set Up界面）。：產(chǎn)生Calibration Report，報(bào)告中包含所有你輸入的信息，儀器當(dāng)前的設(shè)置，調(diào)試結(jié)果，F(xiàn)SC及FL1的直方圖等。它的作者是：Dr. Joseph Trotter， the Scripps Research Institute, San Diego, USA (Dr. Trotter‘s address trotter)。2. 軟件與儀器的連接 WinMDI是一款純分析型的軟件，它不與任何流式細(xì)胞儀相連接。Histogram為顯示直方圖Dotplot為顯示二維散點(diǎn)圖Density Plot為密度圖Contour為輪廓圖。點(diǎn)擊峰的左右以設(shè)定Marker邊界。完成后點(diǎn)擊“OK”。打印頁(yè)面設(shè)置從屏幕上方File，選擇Format Print Page。 選擇Copy，點(diǎn)擊 Format Print Page 激活窗口。Undo、Cut、Copy、Paste、Delete、Select All、Copy Graphics Format、Empty Clipboard、View Clipboard。SYSTEMII軟件自身也帶有分析模式，即LISTMODE模式，在這個(gè)狀態(tài)下可直接打開數(shù)據(jù)包，因?yàn)長(zhǎng)MD文件帶有采集方案的信息，故分析時(shí)數(shù)據(jù)直接顯示在原采集方案所定義的直方圖或散點(diǎn)圖中，但無(wú)法更改、新建或刪除直方圖或散點(diǎn)圖。A. 選擇參數(shù)選擇參數(shù)后，可利用屏幕右上方的User Name 將所選擇的信號(hào)改成用戶需要的名稱，如將FL1 LOG 改為FITC于屏幕右下方用鼠標(biāo)將需要的參數(shù)點(diǎn)成黃色B. 利用參數(shù)構(gòu)建直方圖用鼠標(biāo)將屏幕右上方的參數(shù)點(diǎn)亮，然后放在直方圖的X、Y 軸，創(chuàng)建需要的直方圖單擊鼠標(biāo)左鍵，將需要設(shè)立分析區(qū)域的直方圖放大將屏幕右下角的REGION EDIT 改為CREATE在屏幕右側(cè)選擇分析區(qū)域類型，連續(xù)點(diǎn)擊即可改變。進(jìn)面得到各亞群的比例。（3） 在各管中加入2ml 1*溶血素，充分混勻，避光反應(yīng)1012min.（4） 300g離心5min，棄上清液（5） PBS洗滌細(xì)胞兩次，300g離心5min，棄上清液（6） 1% 上機(jī)檢測(cè)（Simultest IMK Lymphocytes專用軟件也可以使用Cellquest軟件）；分析結(jié)果；打印實(shí)驗(yàn)報(bào)告，圖： 三色熒光分析血液淋巴細(xì)胞免疫表型 材料BD CaliBRITE 3熒光校準(zhǔn)微球，已知數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)熒光計(jì)數(shù)微球的BD TruCOUNT管。基本上表達(dá)在機(jī)體所有有核細(xì)胞上，特別是淋巴細(xì)胞表面有豐富的含量。 在進(jìn)行HLAB27抗原檢測(cè)之前，要用熒光微球來(lái)校準(zhǔn)儀器，包括調(diào)節(jié)FL1和FSC。 10X Lysing Solution 30ml167。167。質(zhì)量控制：先用HLAB27標(biāo)準(zhǔn)微球校準(zhǔn)儀器，設(shè)定正確的“MARK”。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意避光、避免抗體、血液粘附于試管壁，否則細(xì)胞不能被染色或染色不充分，而影響檢驗(yàn)結(jié)果。在BD公司的HLAB27自動(dòng)軟件下獲取15000個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)其中的T淋巴細(xì)胞HLAB27熒光強(qiáng)度,進(jìn)行數(shù)據(jù)自動(dòng)分析。 單克隆抗體與外周血共孵育，裂解紅細(xì)胞，洗滌固定后上機(jī)檢測(cè)。 軟件FACSComp：167。若HLAB27表達(dá)水平大于標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定MARK，則為陽(yáng)性結(jié)果；若HLAB27表達(dá)水平低于標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定MARK，則為陰性結(jié)果。染色和固定細(xì)胞：（1）取四只流式專用管，并標(biāo)記A，B、C、D。作用：除了校準(zhǔn)熒光靈敏度之外，還要調(diào)節(jié)儀器條件。選擇所要的分析區(qū)域，如A，并將其點(diǎn)亮，放在所要GATED 的直方圖上方。軟件與儀器的連接開機(jī)程序開啟計(jì)算機(jī)，雙擊“XLON”圖標(biāo)，啟動(dòng)流式細(xì)胞儀。Histogram、Dotplot、Densityplot、Contour、Format、Retain Markers、Screen Stats、Edit Stats?？梢姷诙€(gè) 點(diǎn)圖出現(xiàn)在該P(yáng)rint 。 點(diǎn)擊 FSC Vs. SSC 點(diǎn)圖使顏色由灰變藍(lán)激活點(diǎn)圖。右擊該點(diǎn)圖，選擇“Gates”，出現(xiàn)“Logic gate tool”對(duì)話框，從對(duì)話框的“Region”中選擇所要分析的Region，并從其右側(cè)的Logic中建立需要的邏輯