【正文】 at、Retain Markers、Screen Stats、Edit Stats。 FACSPress軟件使用 System II軟件使用 SYSTEMII軟件運行于Coulter XL型流式細(xì)胞儀上，操作系統(tǒng)為MSDOS，該軟件運行穩(wěn)定功能比較全面。因為運行在DOS狀態(tài)下，與現(xiàn)在的Windows不兼容，故在圖形輸出時會比較繁瑣。軟件數(shù)據(jù)流程SYSTEMII軟件數(shù)據(jù)分為兩個部分：方案和數(shù)據(jù)包。SYSTEMII中的方案僅供數(shù)據(jù)采集用。數(shù)據(jù)以LISTMODE方式保存，生成后綴為LMD的文件，可用第三方軟件進(jìn)行分析。SYSTEMII軟件自身也帶有分析模式，即LISTMODE模式，在這個狀態(tài)下可直接打開數(shù)據(jù)包，因為LMD文件帶有采集方案的信息，故分析時數(shù)據(jù)直接顯示在原采集方案所定義的直方圖或散點圖中，但無法更改、新建或刪除直方圖或散點圖。這一點是該軟件最大的缺陷。軟件與儀器的連接開機程序開啟計算機，雙擊“XLON”圖標(biāo)，啟動流式細(xì)胞儀。預(yù)熱30分鐘，儀器提示：Insert Sample Tube。關(guān)機程序退出SYSTEM II 軟件若在DOS 方式下開機，則在C:\XL狀態(tài)下鍵入“XLOFF”若在WIN 方式下開機，則返回WINDOWS 界面，雙擊“XLOFF”圖標(biāo)依次關(guān)閉計算機主機，打印機，電源箱開關(guān)。方案與數(shù)據(jù)之間的關(guān)系SYSTEMII所建立的方案只能用于采集數(shù)據(jù)，而不能用作分析。數(shù)據(jù)保存后可在LISTMODE下打開，數(shù)據(jù)會顯示在原采集方案所構(gòu)建的圖形中，無法對圖形進(jìn)行修改，但能修改圖中的門或增加、刪除門。方案的建立將SYSTEMII調(diào)節(jié)至Acquirsition狀態(tài)下，所有有關(guān)數(shù)據(jù)采集、新建方案的操作都在此狀態(tài)下進(jìn)行。A. 選擇參數(shù)選擇參數(shù)后，可利用屏幕右上方的User Name 將所選擇的信號改成用戶需要的名稱，如將FL1 LOG 改為FITC于屏幕右下方用鼠標(biāo)將需要的參數(shù)點成黃色B. 利用參數(shù)構(gòu)建直方圖用鼠標(biāo)將屏幕右上方的參數(shù)點亮，然后放在直方圖的X、Y 軸，創(chuàng)建需要的直方圖單擊鼠標(biāo)左鍵，將需要設(shè)立分析區(qū)域的直方圖放大將屏幕右下角的REGION EDIT 改為CREATE在屏幕右側(cè)選擇分析區(qū)域類型，連續(xù)點擊即可改變。單參數(shù)直方圖分析區(qū)域類型:LIN(線性)雙參數(shù)直方圖分析區(qū)域類型：矩形 (REC)任意形(AMO)十字形(QUA)另：數(shù)字形分析區(qū)域：雙參數(shù)直方圖為矩形單參數(shù)直方圖為線性利用GATING 建立直方圖之間的關(guān)系見上圖,在設(shè)立分析區(qū)域的界面下，返回多張直方圖顯示狀態(tài)。選擇所要的分析區(qū)域，如A，并將其點亮，放在所要GATED 的直方圖上方。儀器操作運行待測樣本，調(diào)整以下參數(shù)PMT(光電倍增管)、電壓(Volts)、增益(Gain)、檢測速度(Flow Rate)閾值(Discriminator)、顏色補償(Color Compensation)選擇預(yù)先存儲的方案儀器提示：Insert Sample Tube將陰性對照的樣本管放入樣本臺上，儀器會自動檢測樣本管并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集利用FastSet進(jìn)行電壓的調(diào)整，DISPLAY OPTIONFASTSET用鼠標(biāo)左鍵點擊FastSet，出現(xiàn)十字標(biāo)記后，將鼠標(biāo)移至所需調(diào)整的細(xì)胞群，按住左鍵進(jìn)行調(diào)整，松開左鍵后,。在任何條件不變的情況下，進(jìn)行樣本測試。若為雙色以上分析，注意調(diào)整顏色補償調(diào)整顏色補償：利用FAST COMP 進(jìn)行調(diào)整DISPLAY OPTIONFAST COMP用鼠標(biāo)點擊FAST COMP將鼠標(biāo)移置所需補償?shù)募?xì)胞群，拖至正常位置參照前面所述判斷顏色補償是否正確文件的保存及調(diào)用文件的保存條件事先需要在采集方案中設(shè)定好：直方圖存儲方式SAVE/NO SAVE存儲方案重新儲存方案，將原方案覆蓋調(diào)用以前所分析的數(shù)據(jù)：進(jìn)入LISTMODE模式：ACQUISITION LISTMODE SELECT選擇已儲存的文件 OKEYPLAYNEXT將文件及圖形打開SETUP PROTOCOL可以在原有參數(shù)的基礎(chǔ)上重新建立直方圖，設(shè)立直方圖打印方式REGION(右下角)可以重新設(shè)立分析區(qū)域，直方圖之間的關(guān)系…… MultiCycle軟件使用 Modfit使件使用培訓(xùn)人：受訓(xùn)人：培訓(xùn)情況：培訓(xùn)日期：第6章 流式基本檢測項目 淋巴細(xì)胞亞群檢測 （雙色、三色、四色，三種軟件分析）實驗原理：人的淋巴細(xì)胞根據(jù)其生物功能和細(xì)胞表面抗原的表達(dá)可分為三大類：T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK自然殺傷細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞表達(dá)CD3；B淋巴細(xì)胞表達(dá)CD19；NK自然殺傷細(xì)胞表達(dá)CD56或CD16，并且不表達(dá)CD3。利用各種單克隆抗體與淋巴細(xì)胞表面抗原結(jié)合，再配多色熒光染料，即可以把淋巴細(xì)胞區(qū)分為各種亞型。進(jìn)面得到各亞群的比例。調(diào)試機器：軟件FACSComp。作用：除了校準(zhǔn)熒光靈敏度之外，還要調(diào)節(jié)儀器條件。在HLAB27實驗中，F(xiàn)ACSComp的所有條件都要過，才能啟動B27自動軟件。因為B27檢測的是準(zhǔn)確的熒光強度，對靈敏度要求很高。 雙色熒光分析血液淋巴細(xì)胞免疫表型 材料BD Simultest IMK Kit試劑盒，主要成分：CD3 FITC/CD4 PE抗體，CD3 FITC/CD8 PE抗體，CD3 FITC/CD19 PE抗體， CD3 FITC/CD16+CD56 PE抗體，LeucoGATE(CD45 FITC/CD14 PE),FACS Lysing Solution,Isotype Control(鼠IgG1 FITC/IgG2a PE)其他用品準(zhǔn)備：蒸餾水、一次性FALCON管 實驗操作標(biāo)本采集：使用EDTAK2抗凝真空采血管，抽取外周血2ml。染色和固定細(xì)胞：（1） 取六只流式專用管，并標(biāo)記AF。（2） 六管中分別再加入全血100ul，再在各管中分別加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體試劑20ul，充分混勻，避光孵育15min。（3） 在各管中加入2ml 1*溶血素，充分混勻，避光反應(yīng)1012min.（4） 300g離心5min，棄上清液（5） PBS洗滌細(xì)胞兩次，300g離心5min，棄上清液（6） 1% 上機檢測（Simultest IMK Lymphocytes專用軟件也可以使用Cellquest軟件）；分析結(jié)果；打印實驗報告，圖： 三色熒光分析血液淋巴細(xì)胞免疫表型 材料BD CaliBRITE 3熒光校準(zhǔn)微球，已知數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)熒光計數(shù)微球的BD TruCOUNT管。BD TriTEST熒光標(biāo)記抗體，主要成分：CD3 FITC/CD4 PE/CD45 PerCP 抗體CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP 抗體CD3 FITC/CD19 PE/CD45 PerCP 抗體CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP 抗體FACS（10）溶血劑其他用品準(zhǔn)備：PBS、蒸餾水、一次性FALCON管 實驗操作用ACD抗凝采血管收集2ml外周血。染色和固定細(xì)胞：（1）取四只流式專用管，并標(biāo)記A，B、C、D。（2）各管中分別再加入全血100ul，再在各管中分別加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體試劑20ul，充分混勻，避光孵育15min。（3） 在各管中加入2ml 1*溶血素，充分混勻，避光反應(yīng)1012min.（4） 300g離心5min，棄上清液（5） PBS洗滌細(xì)胞兩次，300g離心5min，棄上清液（6） 1% 上機檢測：使用流式細(xì)胞儀，開機以后以CaliBRITE3熒光微球和FACSComp自動軟件檢查儀器靈敏度，并自動設(shè)定實驗的獲取條件，然后進(jìn)入MultiSET自動分析軟件也可以使用Cellquest軟件設(shè)置各T淋巴細(xì)胞亞群門，獲取15000個白細(xì)胞；分析結(jié)果；打印實驗報告，圖： 四色熒光分析血液淋巴細(xì)胞免疫表型 材料MultiTEST? IMK Kit試劑盒，主要成分：CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC 抗體CD3/CD16+CD56/CD45/CD19抗體FACS（10）溶血劑其他用品準(zhǔn)備：蒸餾水、一次性FALCON管 實驗操作用ACD抗凝采血管收集1ml外周血。染色和固定細(xì)胞：（1）取兩只流式專用管，并標(biāo)記A，B。（2）兩管中分別再加入全血50ul（先充分混勻），再在各管中分別加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體試劑20ul并反復(fù)抽吸，充分混勻，避光孵育15min。（3）在各管中加入450ul 1*溶血素，充分混勻，避光反應(yīng)1012min. 上機檢測（MultiSET自動軟件）；分析結(jié)果；打印實驗報告，圖：參考值：(來自于BD公司)總T細(xì)胞（CD3+）： 總B細(xì)胞（CD19+）： 輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞(CD3+CD4+): 抑制/細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD3+CD8+): NK細(xì)胞（CD3CD56+CD16+）： Th/Ts: B27的檢測 HLAB27分析實驗原理：實驗原理：HLAB27屬于1型MHC基因?；旧媳磉_(dá)在機體所有有核細(xì)胞上，特別是淋巴細(xì)胞表面有豐富的含量。使用熒光定量標(biāo)準(zhǔn)微球，校正HLAB27實驗條件后，測定樣本中T淋巴細(xì)胞HLAB27表達(dá)水平。若HLAB27表達(dá)水平大于標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定MARK，則為陽性結(jié)果；若HLAB27表達(dá)水平低于標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定MARK，則為陰性結(jié)果。167。 單克隆抗體與外周血共孵育，裂解紅細(xì)胞，洗滌固定后上機檢測。167。 FITC標(biāo)記的抗HLAB27與HLAB27抗原特異結(jié)合，PE標(biāo)記的抗CD3與人類T淋巴細(xì)胞特異結(jié)合。調(diào)試機器：167。 在進(jìn)行HLAB27抗原檢測之前，要用熒光微球來校準(zhǔn)儀器，包括調(diào)節(jié)FL1和FSC。167。 軟件FACSComp：167。 167。 ACD抗凝管，1ml外周血，溶血素，雙蒸水，PBS（%疊氮鈉），1%多聚甲醛（固定細(xì)胞用）試劑盒介紹：AntiHLAB27 Kit(美國BD公司；CAT:340183)。167。 AntiHLAB27 Kit: AntiHLAB27 FITC/CD3PE 167。 HLAB27 Calibration beads 167。 10X Lysing Solution 30ml167。 167。 單克隆抗體與外周血共孵育，裂解紅細(xì)胞，洗滌固定后上機檢測。：167。 采靜脈血1ml,肝素抗凝。 取30μl抗HLAB27 FITC/抗CD3PE抗體于試管中,加入50μl抗凝血，混勻，室溫避光孵育15 min。然后加入1∶10 稀釋的裂解液2 ml，避光12 min，待紅細(xì)胞完全溶解后，立即300 g離心5 min，棄上清，用PBS洗滌1次，同上離心后棄上清。加入500 μl PBS重懸細(xì)胞，以備上機檢測。167。 ： 先用CaliBRITE beads和HLAB27 calibration beads 調(diào)試機器，并通過試劑批號的后綴確定界值（decision maker）的位置。在BD公司的HLAB27自動軟件下獲取15000個細(xì)胞，檢測其中的T淋巴細(xì)胞HLAB27熒光強度,進(jìn)行數(shù)據(jù)自動分析。 HLAB27檢測結(jié)果臨床意義：HLAB27抗原表達(dá)與強直性脊椎炎發(fā)病具有高度的疾病相關(guān)性。在強直性脊椎炎患者中，95%以上個體是HLAB27抗原陽性；而在健康人群中HLAB27抗原表達(dá)陽性者不足7%。HLAB27陽性個體的該病相對危險率達(dá)300%以上?，F(xiàn)今發(fā)現(xiàn)與HLAB27高度相關(guān)的疾病主要有：強直性脊椎炎、萊特?。òǜ篂a、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、尿道炎的綜合癥）和急性葡膜炎。最近研究還認(rèn)為與心肌炎等心臟病有關(guān)。質(zhì)量控制：先用HLAB27標(biāo)準(zhǔn)微球校準(zhǔn)儀器，設(shè)定正確的“MARK”。收集T細(xì)胞太少（少于500個）、碎片污染太多（超過10%）、門中T淋巴細(xì)胞不純（小于90%）可能引起實驗結(jié)果不正確。整個實驗過程中注意避光、避免抗體、血液粘附于試管壁，否則細(xì)胞不能被染色或染色不充分，而影響檢驗結(jié)果。溶血時間不宜過長，否則會引起白細(xì)胞破碎。 血小板抗體檢測血小板分析的臨床應(yīng)用 血小板活化導(dǎo)致的血栓前綜合癥：如非免疫性血小板活化 血管缺陷導(dǎo)致的血小板活化：如動脈粥樣硬化、急性心肌梗塞、血管成型術(shù)、心臟移植 血小板糖蛋白的基因缺失，或血小板存儲缺陷導(dǎo)致的出血性疾病 骨髓異常增生或骨髓發(fā)育不良、腎衰末期、血小板輸血或藥物副作用引起的血小板止血功能障礙 血小板相關(guān)的抗凝治療的診斷監(jiān)測 由特發(fā)性血小板減少或藥物引發(fā)的血小板減少、惡性腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的血小板生成減少 免疫性血小板減少、先兆子癇或膿毒癥造成的血小板生成增加；生長因子治療的骨髓反應(yīng)狀況監(jiān)測 自身免疫和同種免疫造成的血小板減少癥 血小板活化原理用熒光色素標(biāo)記的CD61，CD62P，PAC—1三種單克隆抗體與全血中血小板進(jìn)行直接免疫熒光染色，以光散射