【文章內容簡介】 stafsonB. pumillus GB34WP(Conc.)Fungi in soybeansBio YieldGustafsonB. amyloli quefaciens GB99+B. subtilis GB122Dry flakeFungi on bedding plants in potting mixesSubtilexMicrobio LtdB. subtilis MBI600WP(Conc.)Fungi on cotton, largeseeded legumes, soybeansHi Stick L +SubtilexBeker UnderwoodB. subtilis BI600+rhizobiumFlowableFungi on soybeans, peanuts 枯草芽孢桿菌的研發(fā)存在的問題盡管在枯草芽孢桿菌生物菌劑研究中已經取得了相當矚目的成就，但仍然存在著一些迫于解決的問題。枯草芽孢桿菌作為一種生防微生物，在對農作物施用過程中易受到土壤PH、溫度、土壤微環(huán)境及作物生長狀況等因素的影響，從而使得生物防治效果不穩(wěn)定，還不能夠適用于大范圍的作物施用。大多數(shù)的枯草芽孢桿菌制劑還處于實驗室研究階段，沒有進入實際應用。 產品標準化 在衡量農藥產品的標準中，只把側重點放在藥效上而忽略了有害雜質的含量，沒有明確要求對對有害雜質進行限量導致一些農藥產品產生副作用。2004年國家工商總局組織遼寧地區(qū)市場抽查，共抽查了38個經銷單位的60個產點，%[11]。現(xiàn)在國內沒有嚴格的標準來衡量枯草芽孢桿菌的有效成分，有些以有效殺菌成分為標準，有些以活芽孢數(shù)位標準，而且國家統(tǒng)一的標準來進行有效殺菌成分的檢測。 生產成本高 在枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中分泌的有效殺菌物質較低，而且在生產發(fā)酵過程中容易感染雜菌，種種因素使得發(fā)酵操作要求的成本過高，研究開發(fā)一種新產品所花費的時間較長，應用于農作物后效果不明顯，防治對象單一等等問題都提高了生產成本。 實際應用中存在問題 枯草芽孢桿菌菌劑從實驗室研發(fā)到走向田間是一個復雜的過程，主要問題是菌劑的貨架儲存期短。另外，關于枯草芽孢桿菌的基礎理論研究不夠多，在實際應用過程中，往往要考慮多方面的因素，而不單單是菌劑的作用機理，例如，土壤的溫度、濕度、pH等都可能對枯草芽孢桿菌的活性造成影響，從而使枯草芽孢桿菌活性降低或者使其產生的有效殺菌物質降解，因此防治效果不理想。另外，由于菌劑的價格問題，使得許多農業(yè)生產者不會選擇這類制劑。 立題依據(jù)玉米小斑病是由Bipolaris maydis所引起的一種真菌病害，是甜玉米生育期的常發(fā)性病害。病菌以菌絲和分生孢子在病株殘體上越冬，第二年產生分生孢子，成為初次侵染源。分生孢子靠風力和雨水的飛濺傳播，在田間形成再次侵染。其發(fā)病輕重，和品種、氣候、菌源量、栽培條件等密切相關。一般，抗病力弱的品種，生長期中露日多、露期長、露溫高、田間悶熱潮濕以及地勢低洼、施肥不足等情況下，發(fā)病較重。近年來隨著種植面積的逐年擴大和感病品種的擴種，發(fā)病有加重趨勢，已成為甜玉米的嚴重病害之一。目前生產上用于防治玉米小斑病的化學試劑主要是常用的殺菌劑，玉米小斑病主要用40%克瘟散，50%多菌靈，75%代森錳鋅等藥劑500800倍進行頁面噴霧防治[12]。但效果不是很理想，由于枯草芽孢桿菌對玉米小斑病菌的生長具有抑制作用，因此探討玉米小斑病的生物防治具有重要意義。2. 材料與方法 實驗材料與器材 實驗材料蔗糖，馬鈴薯，麥芽糖，酵母膏，瓊脂，燕麥片，胰蛋白胨，牛肉膏，硫酸銨，K2HPO4,5%孔雀綠溶液，%堿性復紅溶液，香柏油，擦鏡液，無菌水 實驗菌種枯草芽孢桿菌A16（Bacillus subtilis A16） 玉米小斑病菌(Bipolaris maydis) 實驗儀器顯微鏡，酒精燈，載玻片，蓋玻片，吸水紙，膠頭滴管，試管，試管夾，培養(yǎng)皿，三角瓶，燒杯，控溫搖床，移液槍，高壓蒸汽滅菌鍋，電子天平，PH測試儀，接種環(huán)，直尺，無菌操作臺 實驗方法 發(fā)酵種子培養(yǎng) 配制LB培養(yǎng)基①用燒杯稱取32g馬鈴薯，32gNaCl, 16g酵母膏放至鍋中，燒杯用水沖洗，加入部分水，使藥品溶解②用30% NaOH調pH,至7，補齊3200ml水③分裝至6個三角瓶中，每個500ml④121℃滅菌23min。得6500ml LB培養(yǎng)基,待用（以下實驗部分需用不同容量及數(shù)量的LB培養(yǎng)基，按照比例重新配置即可） 活化菌種①將裝有Bacillus subtilis A16的種子瓶拿入無菌操作室，同時將200ml的LB培養(yǎng)基拿進超凈工作臺，紫外滅菌20min.②按1:1000比例，每瓶培養(yǎng)基中加入200μl種子③將接種完的LB培養(yǎng)基放入搖床內36℃,200r/min培養(yǎng)過夜④將種子瓶放回冰箱4℃保存 菌種擴大培養(yǎng)①將上步得到的200ml接種枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基，18500ml LB培養(yǎng)基拿入無菌操作臺，開紫外燈對超凈工作臺滅菌20min左右②把上步試驗中接種到200ml培養(yǎng)瓶中的菌種按照3%的接種量接種到500ml的LB培養(yǎng)基中，共有9L18個大瓶③36℃,200r/min搖床培養(yǎng)，預得上罐前種子 發(fā)酵生產監(jiān)測（對0004,0005,0006罐進行實驗室發(fā)酵罐模擬實驗） 取樣從0004,0005,0006三罐中分別取樣 壓片復染①制作菌種常規(guī)涂片：取潔凈載玻片，滴一滴取樣液于玻片中央，室溫自然干燥，涂面朝上，通過火焰23次進行熱固定②于圖片上滴35滴孔雀綠溶液；用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時開始計時約45min；傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止；%的堿性復紅溶液進行復染1min，水洗； 觀察結果將制作好的壓片置片干燥后用油鏡觀察 Bacillus subtilis A16與Bipolaris maydis的拮抗實驗 各種培養(yǎng)基的配制①酵母浸膏培養(yǎng)液：蔗糖`，酵母浸膏12g，K2HPO4 4g,無菌水1000ml②酵母浸膏培養(yǎng)基：酵母浸膏培養(yǎng)液+瓊脂20g③燕麥培養(yǎng)基：燕麥片30g，瓊脂18g，無菌水1000ml 玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）的培養(yǎng)將玉米葉表面分離的玉米小斑病菌移植于燕麥片培養(yǎng)基上，2530℃培養(yǎng)7d左右，待菌落表面達培養(yǎng)皿面積2/3時，22℃光照培養(yǎng)3d 拮抗細菌（Bacillus subtilis A16）的培養(yǎng)將A,B,C三罐的枯草芽孢桿菌分別接種于盛有150ml酵母浸膏培養(yǎng)液的三角瓶中，30℃，240r/min震蕩培養(yǎng)48h 拮抗實驗以玉米小斑病菌為靶標菌，采用平板對峙法測定枯草芽孢桿菌對玉米小斑病菌的拮抗作用。將2mm2mm大小的玉米小斑病菌菌絲塊接在燕麥培養(yǎng)基中央，25℃培養(yǎng)3d，在離接種處25mm處的左右兩邊等距劃線接種枯草芽孢桿菌，對照組只接種病原菌玉米小斑病菌，25℃培養(yǎng)5d，每組處理3次重復3 實驗結果 發(fā)酵生產監(jiān)測（0004,0005,0006實驗室種子罐）0004罐發(fā)酵試驗進行得比0005,0006罐相對早一些，比0005和0006提前進入發(fā)酵階段，0005和0006罐進行同步發(fā)酵試驗，以下表格記錄三天內三個罐的