【文章內(nèi)容簡介】 stafsonB. pumillus GB34WP(Conc.)Fungi in soybeansBio YieldGustafsonB. amyloli quefaciens GB99+B. subtilis GB122Dry flakeFungi on bedding plants in potting mixesSubtilexMicrobio LtdB. subtilis MBI600WP(Conc.)Fungi on cotton, largeseeded legumes, soybeansHi Stick L +SubtilexBeker UnderwoodB. subtilis BI600+rhizobiumFlowableFungi on soybeans, peanuts 枯草芽孢桿菌的研發(fā)存在的問題盡管在枯草芽孢桿菌生物菌劑研究中已經(jīng)取得了相當(dāng)矚目的成就，但仍然存在著一些迫于解決的問題?？莶菅挎邨U菌作為一種生防微生物，在對農(nóng)作物施用過程中易受到土壤PH、溫度、土壤微環(huán)境及作物生長狀況等因素的影響，從而使得生物防治效果不穩(wěn)定，還不能夠適用于大范圍的作物施用。大多數(shù)的枯草芽孢桿菌制劑還處于實驗室研究階段，沒有進入實際應(yīng)用。 產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化 在衡量農(nóng)藥產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)中，只把側(cè)重點放在藥效上而忽略了有害雜質(zhì)的含量，沒有明確要求對對有害雜質(zhì)進行限量導(dǎo)致一些農(nóng)藥產(chǎn)品產(chǎn)生副作用。2004年國家工商總局組織遼寧地區(qū)市場抽查，共抽查了38個經(jīng)銷單位的60個產(chǎn)點，%[11]。現(xiàn)在國內(nèi)沒有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來衡量枯草芽孢桿菌的有效成分，有些以有效殺菌成分為標(biāo)準(zhǔn)，有些以活芽孢數(shù)位標(biāo)準(zhǔn)，而且國家統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來進行有效殺菌成分的檢測。 生產(chǎn)成本高 在枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中分泌的有效殺菌物質(zhì)較低，而且在生產(chǎn)發(fā)酵過程中容易感染雜菌，種種因素使得發(fā)酵操作要求的成本過高，研究開發(fā)一種新產(chǎn)品所花費的時間較長，應(yīng)用于農(nóng)作物后效果不明顯，防治對象單一等等問題都提高了生產(chǎn)成本。 實際應(yīng)用中存在問題 枯草芽孢桿菌菌劑從實驗室研發(fā)到走向田間是一個復(fù)雜的過程，主要問題是菌劑的貨架儲存期短。另外，關(guān)于枯草芽孢桿菌的基礎(chǔ)理論研究不夠多，在實際應(yīng)用過程中，往往要考慮多方面的因素，而不單單是菌劑的作用機理，例如，土壤的溫度、濕度、pH等都可能對枯草芽孢桿菌的活性造成影響，從而使枯草芽孢桿菌活性降低或者使其產(chǎn)生的有效殺菌物質(zhì)降解，因此防治效果不理想。另外，由于菌劑的價格問題，使得許多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者不會選擇這類制劑。 立題依據(jù)玉米小斑病是由Bipolaris maydis所引起的一種真菌病害，是甜玉米生育期的常發(fā)性病害。病菌以菌絲和分生孢子在病株殘體上越冬，第二年產(chǎn)生分生孢子，成為初次侵染源。分生孢子靠風(fēng)力和雨水的飛濺傳播，在田間形成再次侵染。其發(fā)病輕重，和品種、氣候、菌源量、栽培條件等密切相關(guān)。一般，抗病力弱的品種，生長期中露日多、露期長、露溫高、田間悶熱潮濕以及地勢低洼、施肥不足等情況下，發(fā)病較重。近年來隨著種植面積的逐年擴大和感病品種的擴種，發(fā)病有加重趨勢，已成為甜玉米的嚴(yán)重病害之一。目前生產(chǎn)上用于防治玉米小斑病的化學(xué)試劑主要是常用的殺菌劑，玉米小斑病主要用40%克瘟散，50%多菌靈，75%代森錳鋅等藥劑500800倍進行頁面噴霧防治[12]。但效果不是很理想，由于枯草芽孢桿菌對玉米小斑病菌的生長具有抑制作用，因此探討玉米小斑病的生物防治具有重要意義。2. 材料與方法 實驗材料與器材 實驗材料蔗糖，馬鈴薯，麥芽糖，酵母膏，瓊脂，燕麥片，胰蛋白胨，牛肉膏，硫酸銨，K2HPO4,5%孔雀綠溶液，%堿性復(fù)紅溶液，香柏油，擦鏡液，無菌水 實驗菌種枯草芽孢桿菌A16（Bacillus subtilis A16） 玉米小斑病菌(Bipolaris maydis) 實驗儀器顯微鏡，酒精燈，載玻片，蓋玻片，吸水紙，膠頭滴管，試管，試管夾，培養(yǎng)皿，三角瓶，燒杯，控溫?fù)u床，移液槍，高壓蒸汽滅菌鍋，電子天平，PH測試儀，接種環(huán)，直尺，無菌操作臺 實驗方法 發(fā)酵種子培養(yǎng) 配制LB培養(yǎng)基①用燒杯稱取32g馬鈴薯，32gNaCl, 16g酵母膏放至鍋中，燒杯用水沖洗，加入部分水，使藥品溶解②用30% NaOH調(diào)pH,至7，補齊3200ml水③分裝至6個三角瓶中，每個500ml④121℃滅菌23min。得6500ml LB培養(yǎng)基,待用（以下實驗部分需用不同容量及數(shù)量的LB培養(yǎng)基，按照比例重新配置即可） 活化菌種①將裝有Bacillus subtilis A16的種子瓶拿入無菌操作室，同時將200ml的LB培養(yǎng)基拿進超凈工作臺，紫外滅菌20min.②按1:1000比例，每瓶培養(yǎng)基中加入200μl種子③將接種完的LB培養(yǎng)基放入搖床內(nèi)36℃,200r/min培養(yǎng)過夜④將種子瓶放回冰箱4℃保存 菌種擴大培養(yǎng)①將上步得到的200ml接種枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基，18500ml LB培養(yǎng)基拿入無菌操作臺，開紫外燈對超凈工作臺滅菌20min左右②把上步試驗中接種到200ml培養(yǎng)瓶中的菌種按照3%的接種量接種到500ml的LB培養(yǎng)基中，共有9L18個大瓶③36℃,200r/min搖床培養(yǎng)，預(yù)得上罐前種子 發(fā)酵生產(chǎn)監(jiān)測（對0004,0005,0006罐進行實驗室發(fā)酵罐模擬實驗） 取樣從0004,0005,0006三罐中分別取樣 壓片復(fù)染①制作菌種常規(guī)涂片：取潔凈載玻片，滴一滴取樣液于玻片中央，室溫自然干燥，涂面朝上，通過火焰23次進行熱固定②于圖片上滴35滴孔雀綠溶液；用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時開始計時約45min；傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止；%的堿性復(fù)紅溶液進行復(fù)染1min，水洗； 觀察結(jié)果將制作好的壓片置片干燥后用油鏡觀察 Bacillus subtilis A16與Bipolaris maydis的拮抗實驗 各種培養(yǎng)基的配制①酵母浸膏培養(yǎng)液：蔗糖`，酵母浸膏12g，K2HPO4 4g,無菌水1000ml②酵母浸膏培養(yǎng)基：酵母浸膏培養(yǎng)液+瓊脂20g③燕麥培養(yǎng)基：燕麥片30g，瓊脂18g，無菌水1000ml 玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）的培養(yǎng)將玉米葉表面分離的玉米小斑病菌移植于燕麥片培養(yǎng)基上，2530℃培養(yǎng)7d左右，待菌落表面達培養(yǎng)皿面積2/3時，22℃光照培養(yǎng)3d 拮抗細(xì)菌（Bacillus subtilis A16）的培養(yǎng)將A,B,C三罐的枯草芽孢桿菌分別接種于盛有150ml酵母浸膏培養(yǎng)液的三角瓶中，30℃，240r/min震蕩培養(yǎng)48h 拮抗實驗以玉米小斑病菌為靶標(biāo)菌，采用平板對峙法測定枯草芽孢桿菌對玉米小斑病菌的拮抗作用。將2mm2mm大小的玉米小斑病菌菌絲塊接在燕麥培養(yǎng)基中央，25℃培養(yǎng)3d，在離接種處25mm處的左右兩邊等距劃線接種枯草芽孢桿菌，對照組只接種病原菌玉米小斑病菌，25℃培養(yǎng)5d，每組處理3次重復(fù)3 實驗結(jié)果 發(fā)酵生產(chǎn)監(jiān)測（0004,0005,0006實驗室種子罐）0004罐發(fā)酵試驗進行得比0005,0006罐相對早一些，比0005和0006提前進入發(fā)酵階段，0005和0006罐進行同步發(fā)酵試驗，以下表格記錄三天內(nèi)三個罐的