層析和膜技術在生物制藥中的應用(編輯修改稿)
2025-02-09 22:21 本頁面
【文章內容簡介】 并不是按分子量大小的順序，而是按照吸附作用強弱的順序，其中二個酸性氨基酸，谷氨酸（ ），甘氨酸（ ）先被流出，而 pI分別為 ，酪氨酸，由于是苯環(huán)化合物，存在弱吸附故后被流出，而色氨酸是雜環(huán)合物，堿性氨基酸，吸附最強，所以最后流出 . 凝膠層析的應用 ?分子量測定 ?測定依據：不同分子量的物質，只要在凝膠的分離范圍內（滲入限與排阻限之間），其洗脫體積Ve及分配系數 Kd值隨分子量增加而下降。 ?待測物質洗脫體積與分子量關系符合下式： Ve=KlogM+C K、 C 是常數，為直線方程的斜率和外推截距。 同時 Kav=K′logM +C 凝膠層析的應用 ?測定分子量方法：標準曲線法。 ?先以 3個以上的已知分子量的標準蛋白（有標準蛋白商品出售）過柱，測取各目 Ve值，以 Ve做縱坐標， logM 做橫坐標制作標準曲線，之后在同一測定系統測取未知物質的 Ve值，即可由標準曲線求得分子量。 ?注意：測得的分子量是近似分子量，誤差在 177。 10%。 ?該法操作簡便，需要樣品量較少，實用價值較大。 凝膠層析的應用 :分子量測定 三 . 親和層析 ? 人們發(fā)現生物體中許多高分子化合物具有和某些相對應的專一分子可逆結合的特性， ? 例如 酶與底物、抗原與抗體、激素與受體、核糖核酸與其互補的脫氧核糖核酸，多糖與蛋白復合體等，都具有這種特性。 ? 生物分子間的這種結合能力稱為親和力，根據生物分子特異親和力而設計的層析技術稱為親和層析，在親和層析中起可逆結合的特異性物質稱為配基，與配基結合的層析介質稱為載體。 親和層析的設計原理和過程 : ?由于親和層析技術具有簡便，快速、專一和高效等特點，應用十分廣泛，已普及到生命科學的各個領域。 ?應用范圍如下： （ 1）提取、分離純化、濃縮各類生物分子； （ 2）分離純化各種功能細胞，細胞器，膜片段和病毒顆粒； （ 3）用于各種生化成分的分析檢測； （ 4）其他； ?最大優(yōu)點：利用它從粗提液中經過一次簡單的處理便可得到所需的高純度活性物質。 ? 例如分離胰島素受體時，把胰島素作為配基，偶聯于瓊脂載體上，經親和層析，從肝臟勻漿中提取胰島素受體，純化達 8000倍。 金屬螯合親和層析 ?原理：蛋白質分子能夠與金屬離子發(fā)生親和反應，并與之結合，可用于吸附純化蛋白質。蛋白質表面的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基團、半胱氨酸的巰基、色氨酸的吲哚基團，可提供電子，與金屬離子結合，從而發(fā)生親和層析。配基與生物大分子的結合機理包括范德華力、疏水鍵、靜電以及金屬螯合作用。 金屬螯合親和層析柱的制備： 將環(huán)氧活化型 Sepharose 6B與金屬螯合劑（如亞氨二醋酸）偶聯成配基，再用金屬離子溶液處理（如Zn2+、 Cu2+、 Co2+、 Ni2+、 Cd2+），即成。 金屬螯合親和層析 ?上樣：柱子經平衡后，可將含有生物活性物質的樣品上柱，與固定化的金屬配基復合物有親和力的分子都將被滯留，其余則流出柱外。 ? 洗脫：可通過改變鹽的濃度、改變 pH、或由競爭性的試劑將蛋白質置換下來，這些方式的機理都是通過降低固定化金屬離
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