【文章內(nèi)容簡介】 升培養(yǎng)基中所需要加入 lN 的 NaOH 或 HCl 的毫升數(shù)(注意這次是作 500 毫升培養(yǎng)基)，加蒸餾水稀釋的目的防止調(diào)節(jié)過程中培養(yǎng)基凝固。調(diào)節(jié) pH 至中性的簡便方法是用石蕊示紙。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培養(yǎng)基和溴百里酚藍(lán)或其它指示劑 1—2 滴，根據(jù)顏色反應(yīng)，在所配的培養(yǎng)液中加入少量 lN 的NaOH 或 HCl，然后再取樣測定，如此反復(fù)多次，達(dá)到所需求的反應(yīng)為止。 5 人分為一組，4 兩組各作此培養(yǎng)基 500 毫升，其中 200 毫升分裝試管，每管約13 / 66100 毫升，滅菌后擺成斜面，其余 300 毫升分裝在 3 個(gè) 250—300 毫升的三角瓶中，每瓶裝100 毫升左右，滅菌后妥善存放，留待下次實(shí)驗(yàn)使用。 圖： 培養(yǎng)基的分裝裝置與棉塞。A. 培養(yǎng)基的分裝 ，外部太松B. 棉塞的做法 ，外部太短松此外，4 各組均制備 15 管試管裝和 2 瓶三角瓶裝的無菌水。 (二)培養(yǎng)基的滅菌 為了得到某種病原物的純培養(yǎng)，配好的培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌才能使用，滅菌是指用物理或化學(xué)方法完全殺死器物表面及其內(nèi)部的所有微生物，滅菌與消毒的概念不同，消毒則是指消滅器物或植物組織表面的某些微生物(能常稱雜菌)，而不是消滅所有的微生物。 滅菌的方法很多，植病實(shí)驗(yàn)室常用的有干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌兩種方法，一般培養(yǎng)皿、吸管等玻璃儀器用干熱滅菌法進(jìn)行滅菌。而培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)用的土壤，則用高壓蒸汽滅菌法進(jìn)行滅菌，具體滅菌方法和步驟如下： 1 干熱滅菌法 (1)將培養(yǎng)皿、吸管等玻璃器皿洗凈干燥后，用舊報(bào)紙包好，或裝入特制的鐵筒中(每個(gè)吸管用紙包好后裝入鐵筒)，包紙時(shí)應(yīng)將吸取的一端放在取時(shí)先折開的一端，以便取用時(shí)手勿觸及要求滅菌的一端。 (2)將包裝好的玻璃儀器擺入電熱烘箱中，彼此間留有一定的空隙以便流通空氣。 (3)關(guān)緊箱門，打開排氣孔接上電源。 (4)待箱內(nèi)空氣排出到一定程度時(shí)，閉上排氣孔，繼續(xù)加熱至一定溫度后，用定溫固定溫度，滅菌溫度一般 165℃—175℃保持 1 小時(shí)即可。 (5)待自然降溫冷卻后(60℃以下)才能開門取出玻璃器皿，避免由于溫度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。 2 高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌，它的原理是利用高壓來提高蒸汽的溫度，達(dá)到滅菌的目的，其操作步驟如下： (1)關(guān)好排水閥門放入清水至標(biāo)度為止，注意水量一定要加足，否則容易造成事故。 (2)將要滅菌的培養(yǎng)基、滅菌水等裝入鐵絲籠中，并用牛皮紙蓋好后放入滅菌鍋中，關(guān)上器蓋，旋緊螺旋時(shí)，先將每個(gè)螺旋旋轉(zhuǎn)到一定程度(不要太緊)，然后再旋緊相對的兩個(gè)螺旋，以達(dá)到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達(dá)不到徹底滅菌的目的。14 / 66 (3)通電加溫，同時(shí)打開排氣活門，排盡鍋內(nèi)的空氣，即活門沖出的全部是蒸氣時(shí)則表示徹底，此時(shí)可關(guān)閉排氣活門，如果過早關(guān)閉活門，排氣不徹底，也達(dá)不到徹底滅菌的目的。通常當(dāng)壓力表指針升至 5 磅時(shí)，打開排氣活門放氣，降至零點(diǎn)，再關(guān)閉活門。 (4)壓力表的指針上升時(shí)，鍋內(nèi)溫度也逐漸升高，當(dāng)壓力表指針升至 15 磅時(shí)，蒸氣溫度相當(dāng)于 120℃—121℃(等于一個(gè)大氣壓)，此時(shí)開始計(jì)算滅菌時(shí)間，控制熱源，使處于 15磅壓力保持 30 分鐘，即能達(dá)到完全滅菌的目的，然后停止加溫。 (5)稍微打開一點(diǎn)排氣活門，使鍋內(nèi)蒸氣緩慢排除，然后逐漸開大活門，氣壓徐徐下降，注意勿使排氣過快，否則會使鍋內(nèi)的培養(yǎng)基沸騰而沖脫或沾濕棉花塞，但排氣太慢又使培養(yǎng)基在鍋內(nèi)，受高溫處理時(shí)間過長，這樣對培養(yǎng)基也是不利的。一般從排氣到打開鍋蓋以10 分鐘左右為好。 (6)當(dāng)壓力表指針降到零、鍋內(nèi)蒸氣完全排盡時(shí)，打開鍋蓋取出培養(yǎng)基，如需制備固體斜面培養(yǎng)基時(shí)，則應(yīng)趁熱將試管斜放在桌上，上面蓋上報(bào)紙以免落灰塵，冷卻后便可收起。 (7)最后將高壓滅菌器內(nèi)的剩余水排出。 (8)抽取上述滅菌的培養(yǎng)基，放入 25℃溫箱中，48 小時(shí)后不見雜菌生出，便證明培養(yǎng)基已達(dá)到滅菌目的，可以使用。 此外，有些培養(yǎng)基在經(jīng)高壓滅菌后，其營養(yǎng)成分容易分解而失去使用價(jià)值，此時(shí)可采用間歇蒸氣滅菌法，即將培養(yǎng)基放入高壓滅菌器內(nèi)，加熱至 100℃，保持 1 小時(shí)，每天滅菌一次，連續(xù)進(jìn)行三次，即可達(dá)到滅菌的目的，又不至使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)分解。三、思考題 1 培養(yǎng)基有哪幾種類別? 各有什么特點(diǎn)和用途? 2 干熱滅菌和高壓蒸汽法適用范圍如何? 電熱烘箱和高壓鍋如何操作? 各有哪些使用注意事項(xiàng)? 3 怎樣檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底?2－3 植物病原菌的分離和培養(yǎng) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 在研究病原菌的形態(tài)、生理、生態(tài)以及病原菌對寄主植物的致病性等多種試驗(yàn)中，常常需要病原菌的純培養(yǎng)物。然而，在自然情況下，病原菌通常是與其他雜菌混生在一起的，從受病組織或其他基物中將病原菌單獨(dú)分選出來，叫作分離。分離和培養(yǎng)是植病實(shí)驗(yàn)室最基本的操作技術(shù)之一。通過本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)植物病原菌分離培養(yǎng)的原理和常用的方法。15 / 66二、內(nèi)容、材料和方法 (一)分離材料的選擇 分離材料的選擇對分離培養(yǎng)的成敗有著決定的影響，因?yàn)樵诟胁≈参锸芎Σ课坏膬?nèi)外，要有多種腐生菌，為減少腐生菌的污染，分離所用的病害材料應(yīng)盡可能新鮮，并且最好在病、健交接處選材取樣。病、健交接處，除材料新鮮，污染的可能性小外，病原菌的生活力強(qiáng)、比較活躍，容易分離成功。 (二)分離方法 病原菌分離的方法因材料不同而異，植病實(shí)驗(yàn)室最常見的方法有組織分離法和稀釋分離法兩種。 ：這種方法適用于大部分病菌的分離，此法又分為小塊組織分離和大塊組織分離兩種方法。分別以玉米大斑病、小麥根腐病和梨褐腐病為試材進(jìn)行。 (1)葉斑病類病原菌的分離（玉米大斑病病菌的分離） 取玉米大斑病病葉，在病、健交界處剪取 2—3 毫米長的病組織。用 10%漂白粉（次氯酸鈣）溶液消毒（漂白粉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）35min，時(shí)間長短依病組織不同而異，然后直接移至 PSA 平板培養(yǎng)基上(為防止細(xì)菌污染，可在培養(yǎng)基中加入 1000ppm 鏈霉素 10 毫升)，倒置于 20—25℃室溫下，待菌落長出后挑取前緣菌絲，回接于 PSA 斜面培養(yǎng)基上，在 25℃溫箱中培養(yǎng)，待菌落顏色變深后，在無菌條件下鏡檢是否是玉米大斑病菌，弱僅有玉米大斑病菌的孢子，則說明已獲得了純培養(yǎng)，否則，則需要繼續(xù)轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)。 (2)種子內(nèi)部病原菌的分離（小麥根腐病菌的分離） 選擇典型的小麥黑胚粒 3—4 個(gè)，在 70%的酒精中浸 2—3 秒鐘后，以鑷子夾住投入 %升汞溶液中表面消毒 2—3 分鐘（處理時(shí)間可自 30 秒至 30 分鐘不等），然后取出小麥粒，以滅菌水沖洗 3 次，再移至已倒好的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)基上，注意要以小麥的黑胚部位著靠在培養(yǎng)基上，倒置在 25℃溫箱中培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取前緣菌絲于馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng) 34 天后，無菌條件下鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。 (3)病組織內(nèi)部病原菌的分離（梨褐腐病菌的分離） 取梨褐腐病病果沾取 95%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在燈焰滅過菌的解剖刀在果面病、健交界處切開，挑取豆粒大小的病組織放到馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)基上，每皿放3—4 塊，倒置于 25℃溫箱中培養(yǎng) 2—3 天。菌絲長出后轉(zhuǎn)至馬鈴薯瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 34 天后，無菌條件下鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。 ：稀釋分離法適用于細(xì)菌、土壤菌及產(chǎn)生孢子多的真菌等病原菌的分離，16 / 66本次實(shí)驗(yàn)以白菜軟腐病作為材料進(jìn)行分類離。 白菜軟腐病最易伴生腐生細(xì)菌，分離時(shí)需以病組織接種健康菜幫上，經(jīng)數(shù)次轉(zhuǎn)種予以純化，其純化方法是將菜幫經(jīng)多次換水沖洗后，再用無菌水洗三次，切成適當(dāng)大小，放在15 厘米直徑的培養(yǎng)皿中，菜幫下襯以吸水紙保溫。用無菌解剖刀挑取病組織少許抹在菜幫的人為傷口上，培養(yǎng)在 20—25℃下，經(jīng) 1 天左右呈現(xiàn)腐爛，如此反復(fù)轉(zhuǎn)種幾次，至病斑純凈為止。 分離時(shí)，在新的水爛斑邊緣挑取少量病組織在無菌水試管中配成菌懸液，取滅菌培養(yǎng)皿 3 付，標(biāo)好次序，其內(nèi)各置無菌水 1 毫升，用移置環(huán)移取菌懸液一環(huán)，放在第 1 皿水中混合均勻，從中挑取一環(huán)稀釋液至第 2 皿，再以同法稀釋成第 3 皿，取熔化后冷至 45℃左右的(一般將化好的培養(yǎng)基瓶靠近鼻尖，以不燙為度)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，每皿倒約 15 毫升，沿著桌面輕輕搖勻，凝固后倒置于 26—28℃的溫箱中培養(yǎng)，1—2 日后可見白色，圓形或近圓形直徑為 1—2 毫米的菌落，從中選典型菌落用移植環(huán)（劃線法）移入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每組轉(zhuǎn) 4—5 管，注意過早出現(xiàn)的大型菌落多為腐生細(xì)菌。 以上分離實(shí)驗(yàn)也可以劃線法進(jìn)行，方法是先取兩付滅菌培養(yǎng)皿，每皿倒入約 15 毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，沿桌面輕輕搖勻，制成平板，然后用移置環(huán)沾取一環(huán)稀釋好的菌懸液，在第一個(gè)培養(yǎng)皿平面培養(yǎng)基的左方長方形區(qū)內(nèi)劃平行線 5—7 條，再以此移置環(huán)繼續(xù)向右(和左方小區(qū)內(nèi)的幾條平行線成一定角度)劃 5—7 條平行線，依此法劃兩皿，倒置于26—28℃溫箱中培養(yǎng)，1—2 日后挑單個(gè)典型菌落移到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)待用。 如果因季節(jié)關(guān)系難得白菜軟腐病試材，則可用黃瓜細(xì)菌性角斑病、棉花角斑病、水稻白葉枯病病葉作試材進(jìn)行分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。方法是取新鮮病葉，在病、健交接處取幾小塊病組織，以無菌水經(jīng)多次換洗表面消毒后，放在比色板或凹玻片的凹窩內(nèi)(凹窩要經(jīng)兩次酒精火焰消毒)，以吸管吸取無菌水滴入窩，并以滅菌的玻璃棒搗碎病組織，靜置幾分鐘可得菌懸液，之后以上述劃線法進(jìn)行分離，注意葡萄糖對稻白葉枯病菌有抑制作用，故分離稻白葉枯病菌不能用葡萄糖配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。17 / 66平板劃線操作示意圖三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 (一)清潔環(huán)境：分離工作嚴(yán)格說應(yīng)在無菌條下進(jìn)行，無菌室或無菌箱是分離不可缺少的設(shè)施。若限于條件實(shí)驗(yàn)只能在普通房間進(jìn)行時(shí)，必須對房間進(jìn)行徹底掃除，清潔環(huán)境、搞好衛(wèi)生。地上多灑些水，以消除室內(nèi)塵埃，分離開始前準(zhǔn)備好一切用品，避免工作過程中頻繁走動，以破壞環(huán)境帶來雜菌，工作臺上鋪好濕毛巾，點(diǎn)燃酒精燈。 (二)實(shí)驗(yàn)材料及用品準(zhǔn)備 本次實(shí)驗(yàn) 35 人一組，請認(rèn)真檢查好下試材和用品是否齊備。 1 病組織材料 小麥根腐病黑胚粒 5 粒。 玉米大斑病病葉 1 片。 白菜軟腐病病幫 3 塊(相鄰兩組共用)； 梨褐腐病病果 1 個(gè)(相鄰兩組共用)。 2 用品準(zhǔn)備 %升汞溶液(廣口瓶盛裝)； 95%酒精(廣口瓶盛裝)； 1000ppm 鏈霉素； 瓶裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基； 瓶裝馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基； 此外，還有以下備品，無菌水 1 瓶，滅菌培養(yǎng)皿 6 付，滅菌 1 毫升吸管 2 支，解剖剪、解剖刀和鑷子各 1 把，移植環(huán)，移植鉤、酒精燈、琺瑯盤和試管架各 1 個(gè)，毛巾 1 條，玻璃鉛筆 1 支及火柴等。18 / 66四、思考題 1 分離植物病原菌常用的方法有幾種? 這些方法適用于分離哪類病原菌? 怎樣分離? 2 分離植物病原物時(shí)，為什么要選擇新鮮病材料，并且在病健交界處取樣? 沒有新鮮病材料怎么辦? 3 試分析分離工作成敗的原因。2－4 真菌孢子的萌發(fā) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 欲了解病菌生活力的強(qiáng)弱，生存期的長短，有效傳播距離，抗藥性的大小，生活史，環(huán)境與發(fā)病的關(guān)系以及有些病菌的種類鑒定等，都必須進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)。孢子能否萌發(fā)，萌發(fā)率的高低，萌發(fā)勢的強(qiáng)弱以及萌發(fā)的方式等既受病菌自身內(nèi)在的因素影響，也受外界環(huán)境條件制約，因此要達(dá)到萌發(fā)試驗(yàn)的目的，必須充分掌握萌發(fā)所需的各種條件，本次實(shí)驗(yàn)主要學(xué)習(xí)孢子萌發(fā)常用的方法，同時(shí)通過實(shí)驗(yàn)理解各種孢子萌發(fā)所需條件不同。二、內(nèi)容、材料和方法 孢子萌發(fā)的方法很多，有些真菌的孢子須用特殊的方法才能萌發(fā)，以下僅實(shí)驗(yàn)常用的方法。 (一)懸滴法 1 材料：玉米大斑病菌斜面菌種。 2 方法：在潔凈的蓋玻片中央滴玉米大斑病菌孢子懸浮液一滴，注意滴成圓形，大小適當(dāng)，菌懸液濃度以顯微鏡低倍鏡頭每個(gè)視野約 20 個(gè)孢子為宜。然后翻轉(zhuǎn)蓋片制成懸滴，并封閉在特制的玻環(huán)內(nèi)，再將玻環(huán)放在底部盛少許水的培養(yǎng)皿中，蓋好皿蓋，放置在 26—28℃溫箱中培養(yǎng)，4—5 小時(shí)后檢查萌發(fā)結(jié)果。 此法也可改用直接用培養(yǎng)皿蓋的里面作懸滴進(jìn)行，即用玻璃筆在皿蓋里面劃方格，在方格中央滴孢子懸液，然后慢慢轉(zhuǎn)皿蓋。蓋在盛有少量蒸餾水的皿底上，保溫保濕培養(yǎng)，此法的優(yōu)點(diǎn)是簡便，而且適用于大量孢子萌發(fā)測定。 (二)液滴法 ：小麥根腐病菌斜面菌種。 ：在培養(yǎng)皿內(nèi)放一“井”字或“U”形玻璃棒，皿底加蒸餾水少許或襯上吸水紙或加幾個(gè)脫脂棉球吸水保濕，玻璃棒上放載玻片，其上分別滴 2 或 3 滴小麥根腐病菌孢子懸浮液〔濃度同(一)〕，蓋好皿蓋，置于 26—28℃溫箱中培養(yǎng)，4—5 小時(shí)后，鏡檢萌發(fā)結(jié)果。19 / 66 此法也可發(fā)展為將配好的孢子懸液直接加在培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)，一般一個(gè)培養(yǎng)皿中加10 毫升左右，不能太多，然后直接鏡檢萌發(fā)結(jié)果，優(yōu)點(diǎn)是一次可測定大量孢子。 (三)瓊脂培養(yǎng)基法 對于某些不適于直接在水滴中萌發(fā)的真菌可采用此法。 ：新采集的帶有夏孢子堆的小麥稈銹病病葉或小麥白粉病病葉。 ：取潔凈的載玻片，在熔化并冷至 50℃左右的