【正文】 ，葡萄房枯病菌 。C、球腔菌屬 Mycosphaerella子囊座著生在寄主葉片表皮層下；假囊殼為埋生、球形，或扁圓形，孔口扁平或呈乳頭狀突起。子囊孢子橢圓形、無色，雙胞大小相等。無性世代包括許多屬，如葉點菌屬Phyllosticta，莖點菌屬 Phoma，尾孢屬 Cercospora。代表：禾本科植物黑霉病D、黑星菌屬 Venturia假子囊殼很小，表面生有剛毛，埋生或表生。子囊孢子橢圓形，雙胞大小不等，淡色，個別褐色，可為害植物葉片和果實。無性黑星孢 Fusicladium代表病害：梨黑星病 蘋果黑星病 （5）盤菌①子囊果呈盤狀或杯狀，內生子囊。②子囊盤有些從菌核或假根菌核上長出，③盤菌一般很多不產生分生孢子。④盤菌引起植物病害大多腐生，少數寄生。核盤菌屬 Sclerotinia菌絲體可以形成菌核（真菌核和假菌核），菌核萌發(fā)后可形成長柄子囊盤，子囊棍棒狀，平行排列，有擬側絲。子囊孢子橢圓形或仿綞形，單胞無色。無性世代不發(fā)生。寄主范圍很廣，可侵染 32 科 160 多種植物。代表：油菜、向日葵菌核病1－4 擔子菌亞門及其所致病害的特點 1 銹菌①膠銹菌屬（Gymnosporangium）冬孢子雙細胞，有可以膠化的長柄。沒有夏孢子階段。梨銹?。℅. haraeanum ）冬孢子階段在檜柏上，性孢子和銹孢子在梨樹上引起梨銹病。②柄銹菌屬(Puccinia)孢子雙細胞、有柄，夏孢子單細胞，小麥銹?。盒←湺掍P病( P. graminis )；小麥條銹病(P. striiformis )；小麥葉銹病( P. recondite tritici)。③層銹菌屬（Phakopsora）7 / 66冬孢子單細胞，無柄，不整齊地排列成數層；夏孢子表面有刺。[棗層銹菌（P. ziziphivulgaris ）引起棗樹銹病]。④多胞銹菌屬（Phragmidium ）冬孢子 3 至多細胞，壁厚，表面光滑或有瘤狀突起，柄的基部膨大。[玫瑰多胞銹菌（P. rosaemultiflorae ）引起玫瑰銹病]。⑤單胞銹菌屬（Uromyces ）冬孢子單細胞，有柄，頂壁較厚；夏孢子單細胞，有刺或瘤狀突起。[瘤頂單胞銹菌（）引起菜豆銹病]。⑥柵銹菌屬（Melampsora）冬孢子單細胞，無柄，排列成整齊的一層；夏孢子表面有疣或刺。[亞麻柵銹菌（）引起亞麻銹菌病]。（2）黑粉菌目（Ustilaginales）以雙核菌絲在寄主的細胞間寄生，有吸器伸入寄主細胞內。典型特征是形成黑色粉狀的冬孢子。黑粉菌分類主要以冬孢子的形狀、大小、有無不孕細胞、萌發(fā)的方式及冬孢子球的形態(tài)等。引起園藝植物的病害有：茭白黑粉病、慈。（3）層菌病原菌特征：具較發(fā)達的擔子果，大多腐生，少數是植物病原菌。擔子果如膏藥狀、馬蹄狀、傘狀。層菌常產生有性孢子，很少產生無性孢子。病害主要通過土壤中的菌核、菌絲或菌索進行傳播和蔓延。層菌是弱寄生菌，經傷口侵入到果樹的根部或枝干的維管束，主要破壞木質部，造成根腐或木腐。1－5 半知菌亞門及其所致病害的特點半知菌亞門的主要特點常見的有 4 種：（1）分生孢子梗束（synnema）：呈束狀，基部聚生在一起，頂部分散，著生孢子。（2）分生孢子座（sporodochium）：很短的分生孢子梗聚集而成，墊狀或瘤狀，其上產生分生孢子。（3）分生孢子器（pyidium）：分生孢子器（pyidium）：球形、近球形、瓶狀或不規(guī)則形的子實體，具孔口，孢子梗聚生其內。（4）分生孢子盤（acervulus）：菌絲糾結形成盤狀的子實體，有的分生孢子盤中央或四周具深褐色的剛毛。8 / 66 與園藝植物有關的半知菌(1)叢梗孢菌①粉孢屬(Oidium)分生孢子梗直立。頂部產生菌鍵型的分生節(jié)孢子(粉孢子)。分生孢子串生，單胞無色。引起白粉病，為白粉菌的無性階段 [橡膠粉孢( )引起三葉橡膠樹的白粉病]。②輪枝孢屬(Verticillium)分生孢子梗輪狀分枝，產孢細胞基部略膨大；分生孢子為內生芽殖型，單細胞，卵圓形至橢圓形，單生或聚生?！颤S萎輪枝孢(棉黃萎病菌 )引起棉花黃萎病〕。③青霉屬(Penicillium )分生孢子梗直立，頂端一至多次分枝，形成掃帚狀。分枝頂端產生瓶狀小梗，小梗頂端產生成串的分生孢子，分生孢子球形、單孢。[指狀青霉病菌（ ）引起柑桔綠霉病]。④葡萄孢屬(Botrytis )分生孢子梗無色，頂端細胞膨大成球形，上面有許多小梗；分生孢子單胞，無色，橢圓形，著生小梗上聚集成葡萄穗狀。[灰葡萄孢()引起多種植物灰霉病。]⑤褐孢屬(Fulvia )分生孢子梗黑色，頂端或中部形成分枝，分生孢子黑褐色，卵圓形、圓筒形或不規(guī)則形。引起的病害如番茄葉霉病、黃瓜黑星病等。 ⑥尾孢屬（Cercospora）分生孢子梗屈膝狀，青褐色至黑褐色，分生孢子多細胞，線形、鞭形至蠕蟲形。如花生褐斑病、菜豆紅斑病、豇豆煤霉病等。 ⑦鏈格孢屬(Alternaria )分生孢子梗深色，頂端單生或串生淡褐色至深褐色、磚隔狀的分生孢子。分生孢子倒棍棒形、橢圓形或卵圓形，頂端有喙狀細胞。[大孢鏈格孢(A. macrospora )引起棉花輪紋斑病]。⑧鐮孢霉屬(Fusarium )大型分生孢子多細胞，鐮刀型；小型分生孢子單細胞，橢圓形至卵圓形。麥類赤霉病，瓜類枯萎病。（2）黑盤孢菌9 / 66黑盤孢目真菌的分生孢子梗產生在分生孢子盤上。有的分生孢子盤四周或分生孢子梗之間具有黑色的剛毛。黑盤孢目真菌引起的病害如蘋果褐斑病、蘋果、辣椒、茄子、黃瓜棉花等的炭疽病等。（3）球殼孢菌分生孢子器球形，暗褐色，分生孢子單胞，無色，圓柱形至紡錘形。分生孢子著生在分生孢子器內。引起的病害如蘋果樹腐爛病、梨干腐病、蘋果及梨輪紋病、棉花褐斑病、芹菜斑枯病、茄子褐紋病等。（4）無孢菌:除產生厚垣孢子外，不產生任何其它孢子。只有菌絲體，有時可形成菌核。第二部分 微生物病理實驗基本操作2－1 植物病理徒手制片技術一、實驗目的 觀察植物病害病原物的形態(tài)，進行病原物的分類鑒定，研究受病組織的組織結構病變，受病植物組織與病原物的解剖學關系以及對于難得一見病原物的保存?zhèn)溆玫?，都需將材料制成適當的顯微玻片標本。因此，徒手制片技術也是植物病理學研究的重要手段之一。通過本次實驗系統學習實踐常用的徒手制片技術，為普通植物病理學和農業(yè)植物病理學的深入學習以及以后開展病理學的有關研究工作奠定堅實的制片技術基礎。二、內容、材料和方法 徒手制片的方法有整體封藏法、徒手切片法、組織透明制片法和涂抹制片法等多種。限于時間本實驗實踐最為常用的整體封藏法和徒手切片法兩種。(一)整體封藏法 對于生長在植物病部表面或培基上的菌絲體、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及線蟲等，可直接擇取少許封藏在適當的浮載劑中，在顯微鏡下觀察，根據材料的特點和觀察的目的可采用不同的方法封藏制片。常用的方法的概括為挑、刮、撥、撕四種。 1 挑：對于在植物受病部位或基質表面生長繁茂的霉狀病原體(如霜霉菌)粉狀病原體(如銹菌、白粉菌)以及培養(yǎng)基上的許多培養(yǎng)菌，可用尖細的解剖針等直接挑取封埋制片，挑取病原體的量，在保證選材典型的前提下，越少越好，以免互相重疊，分辯不清。 取黃瓜霜霉病葉，小麥白粉病葉分別挑取霉狀物和粉狀物鏡檢病原菌的形態(tài)特點。10 / 66 2 刮：對病部病原體稀少，或用放大鏡也難辯認霉層的病害標本，可采用兩側具刀的三角刮針(或可用刀片代替)刮取病原物制片。刮的方法是，用刮針的一刃，蘸浮載劑少許，在病部順同一個方向刮取 2—3 次，將刮得的病原蘸在載玻片的浮載劑中封片鏡檢。浮載劑在保證浮載質量的前提下要盡量少，否則少量的病原體在大滴的浮載劑中極易分散漂流，在顯微鏡下難以尋找。取玉米小斑病葉，在病斑背面刮制片，鏡檢分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)。 3 撥：對于產生在植物表皮下或半埋生于基物內的病原體孢子器官。如子囊殼、分生孢子器、閉囊殼等，可將病原體連同寄主組織一同撥下，放入浮載劑中，用兩支解剖針，一支穩(wěn)定材料，另一支撥出植物組織，使病原體外露制片。取小麥全蝕病或白粉病標本，撥小黑點制片，鏡檢子囊果的形態(tài)。 4 撕：對于寄生在植物表皮細胞上的病原真菌，也可以將此有病原物的表皮撕下來制片鏡檢，這種方法不僅能看到病原物形態(tài)，而且可以觀察病原物與寄主的解剖學關系。 在毛毛雨天自田間取回感染白粉病的麥苗(或在保溫箱中取接種染病的麥苗)。用刀片割破葉背表皮再用小鑷子輕輕撕下，放在浮載劑中制片鏡檢白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形態(tài)。(二)徒手切片法 欲觀察受病組織病變，病菌侵入和寄主體內擴展過程，以及埋生在基物內真菌子實體的形態(tài)結構等，都需將有關材料切成薄片，進行鏡檢，徒手切片是最常用的簡便易行的方法，不需要特殊的設備，而且節(jié)省時間，切成的片子不僅可作臨時觀察，也可進一步制成永久性玻片標本。 徒手切片的基本用具是剃刀或刀片。切片時先選取材料并作適當的修整，以左手的食指和姆指捏住材料，中指頂住材料下端，使材料上端突出于手指以上 2—3 毫米。右手握穩(wěn)刀，從左向右后方斜向切割。注意刀口必須以材料面垂直。否則所得切面不正。同時雙手不應緊靠身體，而是要活動自如。用臂力均勻地沿刀口后部起拉向前方，連續(xù)切割 4—5 片后，用毛筆蘸水輕輕沿刀口取下，放入盛有水的淺玻皿中，在此過程中左手握著的材料不要放下，否則再切時難按原位置拿材料，此外，在切片過程中，必須常用毛筆蘸水濕潤材料，以免材料干涸不便切割。 對于過于柔軟或較薄的材料，可以夾在“夾持物”中，進行切片更為方便。新鮮胡鮮卜和馬鈴薯塊都可作“夾持物”用。實驗室中通常將通草、接骨木或向日葵的莖髓，剪成適當大小，浸于 70%酒精中備用。 切割一定數量的薄片后，用移置環(huán)在淺玻皿中選取合用的材料薄片，放在載玻片的水11 / 66滴中，鏡檢合格者即酒精燈上將水烘干并擺正材料，然后加一滴乳酚油或其浮載劑；放在展片臺上略加熱，鏡檢如無氣泡，即可小心加蓋片，用吸水紙吸除多余的浮載劑，最后貼好標簽，平放于切片板上，待干燥適宜時封固。 徒手切片的缺點是對于微小或過大，柔軟、多汁、肉質及堅硬的材料不易切取，也難制成連續(xù)切片，此外切片的厚薄也難一致。切片機切片即可克服這些缺點。三、作業(yè)和思考題 1 每人交兩片符合質量要求的玻片標本。 2 整體封藏法和徒手切片法兩種基本徒手制片技術都在什么情況下使用? 徒手切法制片有什么優(yōu)缺點? 怎樣解決這種方法本身存在的問題?2－2 培養(yǎng)基的配制和滅菌一、 實驗目的 微生物的生長發(fā)育都有一定的營養(yǎng)需要，培養(yǎng)基即人工培養(yǎng)微生物、為其生長發(fā)育提供所需營養(yǎng)的基質。培養(yǎng)基配好后必須經過滅菌方能用于分離培養(yǎng)微生物試驗，因此培養(yǎng)基的配制和滅菌是植物病理實驗室中最基本的工作，通過本次實驗學習植病實驗室中常用培養(yǎng)基的配制方法和高壓滅菌鍋的使用方法。二、內容、材料和方法 (一)培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基按組成成分及對這些成分了解的程度分為天然培養(yǎng)基、半組合培養(yǎng)基和組合培養(yǎng)基三類，從物理性質上又分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩類，培養(yǎng)基的種類不同，配制方法也有差異，限于時間，本次實驗僅配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。1 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA） 這是植病實驗室最常用的培養(yǎng)基(簡稱 PSA)，主要用于植物病原真菌的分離和培養(yǎng)，有時也用于植物病原細菌。 成分：馬鈴薯 200 克 蔗 糖 10 克 瓊 脂 20 克 加水至 1000 毫升 方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，加水煮沸半小時，用雙層紗布濾去薯塊，補足水量，加入瓊脂，加熱熔化，再加糖，待完全化后，乘熱用雙層紗布過濾分裝，塞好棉塞高壓滅菌。12 / 66 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基略帶酸性，培養(yǎng)真菌無需調節(jié) pH，培養(yǎng)細菌則調節(jié) pH 至中性，此培養(yǎng)基留作下次實驗分離培養(yǎng)病原真菌用，故不必調節(jié) pH。 5 人分作一組，2 組各作此培養(yǎng)基 500 毫升，其中 200 毫升分裝試管，每管約 10 毫升，滅菌后擺成斜面；其余 300 毫升，分裝在 3 個 250—300 毫升的三角瓶中，每瓶裝 100毫升左右，滅菌后妥善保存，留待下次實驗使用。2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA） 這種培養(yǎng)基主要用于細菌的分離和培養(yǎng) 成分：牛肉浸膏 3 克 蛋白胨 10 克 蔗糖 10 克 酵母浸膏 1 克 瓊脂 20 克 加水至 1000 毫升 方法：先將瓊脂加熱熔化于大部水中，再將其它各成分用少量水化開加入，調節(jié) pH至 7，趁熱用雙層紗布過濾，分裝，塞棉塞高壓滅菌。 牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易稱重，稱重時用小燒杯盛裝，以玻璃棒沾取，故要先稱好杯和棒的重量后，再開始沾取浸膏稱重，稱后將杯和棒上粘著的浸膏洗凈于鍋中。 調節(jié)培養(yǎng)基 pH 至中性的方法如下：配成 1N 的 HCl 和 NaOH，并另分別稀釋配成 1/20 N 的 HCl 和 NaOH。取培養(yǎng)基 2 毫升，加蒸餾水 毫升，加指示劑溴百里酚藍指示劑 5 滴，這時如培養(yǎng)基的測樣呈黃色則用有刻度吸管加入 1/20 N 的 NaOH 若呈藍色則加入 1/2O N的 HCl，使培養(yǎng)基最后呈草綠色即調節(jié)到中性，此刻所加酸或堿的毫升數的 25 倍即等于在1000 毫