【文章內(nèi)容簡介】 ,Staub J,Cliby W ,et al. Involvement of Hcadherin(CDH13) on 16q in the region of frequent deletion in ovarian cancer. Int J Oncol 1999,15:715720 ZY, Wu, Y., Hedrick, N., and Gutmann, . 2003. Tcadherinmediated cell regulation ivolves G2 phase arrest and requires p21 CIP1/WAF1 expression. Molecular and cellular Biology 2003,23:566578 B, Guo M, Herman JG, et al. Aberrant promoter methylation profiles of tumor suppressor genes in hepatocellular J Pathol. 2003 ,163:11017., RL, Nemeth, E, Tran, H, et al. BRCA1 promoter region hypermethylation in ovarian carcinoma: a populationbased study. Cancer Res 2000, 60: 53295333., DJ, Hibberts, NA, McNicol, AM, et al. Loss of pRb expression in pituitary adenomas is associated with methylation of the RB1 CpG island. Cancer Res 2000, 60: 12111216., JK, Zheng, S, Lafuente, A, et al. Aberrant methylation of p16INK4a in anatomic and genderspecific subtypes of sporadic colorectal cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1999, 8: 501506.24. Toyooka, ., Toyooka,S., Vimani, K., et al. Loss of expression and abrrent methylation of the CDH13 (Hcadherin)gene in breast and lung carcinomas., Cancer Res 2001,61:45564560 A, Meddeb M, Pineau P, et al. Recurrent chromosomal abnormalities in hepatocellular carcinoma detected by parative genomic hybridization.Genes Chromosomes Cancer. 1997,18:5965. J, Ni M, Xu J, et al. Methylation profiling of twenty promoterCpG islands of genes which may contribute to hepatocellular carcinogenesis. BMC Cancer 2002, 2:29項目的 研究內(nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵問題一、研究Tcadherin在肝癌中的基因功能，使其表達(dá)Tcadherin分子，研究表達(dá)Tcadherin分子的肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征的變化，證實(shí)是否Tcadherin重新表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征。 的HepG2細(xì)胞于皮下接種裸鼠，在裸鼠肝癌模型上進(jìn)一步證實(shí)Tcadherin基因的腫瘤抑制基因功能。3．研究Tcadherin基因在肝癌中腫瘤抑制功能的分子機(jī)制。證實(shí)是否Tcadherin在肝癌細(xì)胞株存在與在C6細(xì)胞中一致的分子機(jī)制，即Tcadherin分子通過誘導(dǎo)P21 CIP1/WAF1表達(dá)致使肝癌細(xì)胞于細(xì)胞周期G2期阻滯。二、 在臨床切除的肝癌標(biāo)本中研究Tcadherin基因失活與肝癌惡性分化程度、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系，在人肝癌中揭示Tcadherin基因失活與肝癌的惡性生物學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。，揭示Tcadherin基因表達(dá)水平（失活）與肝癌惡性分化程度、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移（包括合并門靜脈癌栓和衛(wèi)星灶形成）的關(guān)系。，選擇在臨床分期、病理類型及治療方法上具有可比性的肝癌病例，分別選取肝癌切除術(shù)后半年內(nèi)復(fù)發(fā)或肝外轉(zhuǎn)移以及2年 內(nèi)未復(fù)發(fā)或肝外轉(zhuǎn)移的肝癌病例的石蠟標(biāo)本各20例，研究Tcadherin基因的表達(dá)，揭示Tcadherin基因表達(dá)水平（失活）與肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。三、在肝癌細(xì)胞株和裸鼠肝癌種植模型上證實(shí)去甲基化藥物5aza2’deoxycytidine是否能重新誘導(dǎo)Tcadherin表達(dá)，并抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征，觀察其對肝癌的治療價值和可能的毒副作用。擬采取的研究方案及可行性分析一、研究Tcadherin（Tcad）在肝癌中的基因功能的技術(shù)路線 ↓以脂質(zhì)體lipofectin為載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞 ↓以G418篩選表達(dá)Tcad分子的陽性克隆 ↓Western blot鑒定轉(zhuǎn)染后Tcad蛋白表達(dá)↓比較表達(dá)Tcad的陽性克隆與不表達(dá)Tcad的肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特征:細(xì)胞增殖計數(shù) 3H標(biāo)胸腺嘧啶攝取率測定克隆增殖試驗(yàn)細(xì)胞粘附試驗(yàn)細(xì)胞聚集試驗(yàn) Tcadherin（+）或（）的肝癌細(xì)胞（各20只）：腫瘤生長速度腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的時間、累及積器官及頻率裸鼠的生存期 blot檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p53,p21,p27,cyclin D的表達(dá)變化 CIP1/WAF1表達(dá)致使肝癌細(xì)胞于細(xì)胞周期G2期阻滯的分子機(jī)制。二、研究Tcadherin基因失活與臨床肝癌惡性分化程度、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系的技術(shù)路線a. 檢測Tcadherin表達(dá)： 定量PCR；免疫組織化學(xué)；Western blot ，研究Tcadherin缺失表達(dá)（基因失活）與人肝癌發(fā)生的關(guān)系。c. 比較不同病例肝癌中Tcadherin的表達(dá)水平，研究Tcadherin表達(dá)水平與腫瘤病理分級、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移（包括合并門靜脈癌栓和衛(wèi)星灶形成）的關(guān)系。，選擇臨床分期相同、病理類型一致、單個腫瘤大小在2~5cm之間、無肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移、行根治性切除后采用同樣的治療方案的肝癌病例，分別選取肝癌切除術(shù)后半年內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移以及2年內(nèi)未復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的肝癌石蠟標(biāo)本各20例 a. 檢測Tcadherin表達(dá)： 免疫組織化學(xué)b. 回顧研究Tcadherin表達(dá)水平與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系三、研究去甲基化藥物誘導(dǎo)Tcadherin表達(dá)及其治療學(xué)意義的技術(shù)路線。, PLC/PRF/C, TONG 和HA22TNGH中缺失。采用Herman已報導(dǎo)的檢測Tcadherin啟動子甲基化和非甲基序列的引物，進(jìn)一步證實(shí)Tcadherin在上述肝癌細(xì)胞株中的啟動子甲基化現(xiàn)象。擴(kuò)增甲基化序列引物，上游5’TCGCGGGGTTCGTTTTCGC3’，下游5’GACGTTTTCATTCATACGCG3’，擴(kuò)增非甲化序列引物，上游5’TTGTGGGGTTGTTTTGT3’，下游5’AACTTTTCATTCATACACACA3’。 采用Western blot進(jìn)一步證實(shí)Tcadherin在上述存在的啟動子甲基化肝癌細(xì)胞株中蛋白水平表達(dá)缺失。’deoxycytidine（2ug/ml）作用6天后，采用Western blot檢測Tcadherin蛋白水平表達(dá)。 采用細(xì)胞增殖計數(shù)、3H標(biāo)胸腺嘧啶攝取率測定、克隆增殖試驗(yàn)、細(xì)胞粘附試驗(yàn)和細(xì)胞聚集試驗(yàn)檢測Tcadherin表達(dá)前后肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征的變化。（細(xì)胞數(shù)1x107）分別接種60只裸鼠后隨機(jī)分成兩組（每組30只），治療組再分成五組（每組6只），、1ug、2ug、4ug、8ug/克體重每日皮下注射5aza2’deoxycytidin