【正文】 e，共注射一周，對照組僅注射生理鹽水，觀察不同組裸鼠的腫瘤生長速度、腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的時(shí)間、累及器官及頻率及裸鼠的生存期。項(xiàng)目的特色及創(chuàng)新之處1．近年已開始有Tcadherin分子在肝癌、乳腺癌、肺癌及結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著下降、缺失的報(bào)導(dǎo)，推測Tcadherin分子在這些腫瘤中可能扮演腫瘤抑制基因角色。 申請人（黃志勇）最新研究首次證實(shí)Tcadherin在大鼠腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的腫瘤抑制基因功能，并首次揭示其腫瘤抑制功能的分子機(jī)制（Huang Zhiyong等，Molecular and Cellular Biology 2003,23:566578）。但目前尚無人對Tcadherin在肝癌中的基因功能及其分子機(jī)制進(jìn)行研究?；谏暾埲饲捌谑澜珙I(lǐng)先的研究工作基礎(chǔ)，該研究將進(jìn)一步揭示Tcadherin分子在肝癌中的基因功能和其分子機(jī)制，具有世界先進(jìn)性和獨(dú)創(chuàng)性。2. Cadherin分子，如E，Ncadherin分子缺失或突變與多種腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移特征密切相關(guān)，但目前對Tcadherin基因失活與肝癌的侵犯及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特征的關(guān)系目前尚無研究，該研究具有先進(jìn)性和獨(dú)創(chuàng)性。,且 Tcadherin基因啟動(dòng)子甲基化與Tcadherin基因失活密切相關(guān)。但對應(yīng)用去甲基化藥物誘導(dǎo)Tcadherin表達(dá)并研究其對肝癌的治療學(xué)意義目前尚無研究。該研究具有創(chuàng)新性和實(shí)用性。，該研究對進(jìn)一步揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、研究更有效的治療藥物具有重要的科學(xué)及臨床意義。年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究成果研究計(jì)劃及進(jìn)度： 在肝癌細(xì)胞株和裸鼠肝癌模型上研究Tcadherin在肝癌中的基因功能。證實(shí)是否Tcadherin抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征。揭示Tcadherin基因表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特征的分子機(jī)制。 在臨床切除的肝癌標(biāo)本中研究Tcadherin基因失活與肝癌惡性分化程度、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系，揭示Tcadherin的腫瘤抑制基因功能失活與臨床肝癌的惡性生物學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。，并抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征，觀察其對肝癌的潛在的治療價(jià)值治療作用和可能的毒副作用。預(yù)期研究成果：，在國內(nèi)權(quán)威期刊上發(fā)表論文810篇。：（二）研究基礎(chǔ)與工作條件工作基礎(chǔ)：申請人從事腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，肝癌的免疫及基因治療研究多年，發(fā)表研究論文19篇，其中6篇被SCI收錄，影響因子多達(dá)40。在美國華盛頓大學(xué)神經(jīng)腫瘤及分子遺傳研究室從事神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制的研究工作近4年，主要從事腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，利用基因芯片尋找與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的遺傳改變，并利用已知的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的遺傳改變，如Ras激活突變， NF1基因缺失，cdk4過表達(dá)，P53及Rb缺失，并在動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證上述遺傳改變與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。首次利用GFAP啟動(dòng)子成功地建立了腦膠質(zhì)細(xì)胞特異性CDK4基因過表達(dá)的動(dòng)物模型，并揭示了CDK4過表達(dá)與P53基因缺失對腦膠質(zhì)細(xì)胞增殖的協(xié)同作用。該文發(fā)表于Oncogene 2002, 21:13251334（影響因子 ）。該CDK4轉(zhuǎn)基因鼠系正在申請美國專利。同時(shí)，探索研究新基因如Tcadherin和GAP43基因?qū)δX膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系，首次發(fā)現(xiàn)Tcadherin和GAP43是兩個(gè)重要的參與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長調(diào)控的基因，并揭示其調(diào)節(jié)機(jī)制。論文分別發(fā)表于 Molecular and Cellular Biology 2003, 23:566578（影響因子 ）和Cancer Research 2003, 63:29332939（影響因子 ）。參加在美國和印度召開的國際會(huì)議3次，在研究基因功能與腫瘤惡性生物學(xué)特征的關(guān)系、腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制及治療研究領(lǐng)域積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。在對Tcadherin基因的研究中，首次證明了細(xì)胞粘附分子Tcadherin是抑制腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征的重要腫瘤抑制基因，并揭示其分子機(jī)制是Tcadherin分子通過誘導(dǎo)P21 CIP1/WAF1表達(dá)致使腫瘤細(xì)胞于細(xì)胞周期G2期阻滯。該文發(fā)表于Molecular and Cellular Biology 2003,23:566578。這一研究發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究Tcadherin分子在肝癌中的作用、功能及臨床意義奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2 \前期關(guān)于Tcadherin研究的基礎(chǔ)工作：圖1. 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤C6細(xì)胞轉(zhuǎn)染Tcadherin基因后細(xì)胞增殖受抑。 blot顯示轉(zhuǎn)染Tcadherin基因后成熟型（105kDa）和前體（130kDa）Tcadherin分子在C6細(xì)胞中的表達(dá)。而轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3的C6細(xì)胞不表達(dá)Tcadherin。，前者培養(yǎng)皿中形成的細(xì)胞克隆數(shù)顯著低于后者。（P）。黃志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566578圖2. 轉(zhuǎn)染后過度表達(dá)Tcadherin分子的不同C6細(xì)胞克隆的增殖均顯著受抑。A. Western blot證實(shí)Tcadherin成熟型分子（105KDa）和前體分子（130KDa）在轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞后的TTT13克隆細(xì)胞中的表達(dá)。，與轉(zhuǎn)染空載體的VV3克隆相比，TTT13克隆的細(xì)胞增殖顯著受抑。且其增殖受抑的程度與Tcadherin的表達(dá)水平成正相關(guān)。、V3相比，過表達(dá)Tcadherin的C6克隆細(xì)胞（TTT13）在軟瓊脂中形成的克隆數(shù)顯著減少。*表示有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。黃志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566578圖3. Tcadherin在C6細(xì)胞中過表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞伸展性及粘附能力，降低細(xì)胞纖移能力。，Tcadherin過表達(dá)的C6細(xì)胞在Laminin包被的玻片上顯示良好的細(xì)胞伸展性。，Tcadherin過表達(dá)的C6細(xì)胞在種植于fibronectin包被的培養(yǎng)皿后1小時(shí)和4小時(shí)時(shí)，均顯示顯著增強(qiáng)的細(xì)胞粘附能力。*表示有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。，Tcadherin過表達(dá)的C6細(xì)胞在Boyden Chamber中的纖移能力顯著下降。*表示有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。黃志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566578圖4. Tcadherin過表達(dá)C6細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞聚集特征。*表示有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。黃志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566578圖5. 流式細(xì)胞儀分析表明過表達(dá)Tcadherin的C6細(xì)胞克隆于G2/M期細(xì)胞數(shù)顯著增加。、T9和T13及轉(zhuǎn)染空載體后不表達(dá)Tcadherin的C6細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)48小時(shí)同步后，以血清刺激培養(yǎng)12小時(shí)后測定DNA含量。箭頭顯示2N（G1），4N（G2/M）和8N DNA的位置。、S和G2/M期的細(xì)胞分布，過表達(dá)Tcad的TT9克隆于G2/M期細(xì)胞數(shù)顯著高于不表達(dá)Tcad的C6細(xì)胞克隆VV3。（aneuploid，＞4N）。（R2=）。黃志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566578圖6. 過表達(dá)Tcadherin的C6細(xì)胞于G2/M期細(xì)胞的百分比顯著升高。、124和48小時(shí)后，DNA含量測定。、S和G2/M期的分布。、S和G2/M期的分布，G2/M期細(xì)胞比例顯著升高。黃志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566578圖7. 分裂指數(shù)分析顯示Tcadherin過表達(dá)誘導(dǎo)C6細(xì)胞于細(xì)胞周期G2期阻滯。（V2克?。┡c轉(zhuǎn)染Tcadherin基因后表達(dá)Tcadherin的C6細(xì)胞（T3克?。┙?jīng)無血清培養(yǎng)同步化后，以含10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)0、124和48小時(shí)后測定細(xì)胞分裂指數(shù)。與V2細(xì)胞相比，T3細(xì)胞在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯示較低的分裂指數(shù)。，G2/M期細(xì)胞的百分比分別與在124和48小時(shí)測定的分裂指數(shù)一致。而T3克隆，G2/M期細(xì)胞的百分比顯著高于在相同時(shí)間點(diǎn)測定的分裂指數(shù)。*表示有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P）。 iodide細(xì)胞核染色顯示，與空載體轉(zhuǎn)染的C6細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后過表達(dá)Tcadherin的C6細(xì)胞的細(xì)胞核顯著增大、變圓，提示其細(xì)胞分裂受抑。黃志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566578圖8. Tcadheri