【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 and activates the regulator 激活受體被細(xì)胞蛋白酶（蛋白酶）切割，而受體的c末端部分進(jìn)入核酸酶和激活調(diào)節(jié)器664c14. 基因“沉默”由組蛋白修飾及DNA（616）在酵母中的沉默是通過(guò)對(duì)組蛋白的去乙?；图谆閷?dǎo)的（617）在果蠅中，HP1蛋白識(shí)別甲基化的組蛋白和濃縮的染色質(zhì)。DNA甲基化與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的沉默基因相關(guān)聯(lián)?！咀NA甲基化不是組蛋白甲基化】（621）有些基因表達(dá)狀態(tài)在起始信號(hào)不存在時(shí)仍然在細(xì)胞分裂中遺傳。（624）DNA甲基化通過(guò)細(xì)胞分裂維持（625）16. 真核基因調(diào)控在轉(zhuǎn)錄起始后水平HSP70 gene：（597）17. RNAs基因沉默（640）八、分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)n 核酸電泳技術(shù)n 核酸的限制性酶切及片段長(zhǎng)度多態(tài)性n 核酸分子雜交n 核酸體外擴(kuò)增技術(shù)—PCR1. 核酸電泳技術(shù)按照分子量大小，形狀和拓?fù)鋵W(xué)特性進(jìn)行DNA 和 RNA分子的分離216。 DNA 與 RNA 帶負(fù)電荷, 在凝膠中朝正極（＋）移動(dòng)216。 線狀 DNA 分子按照分子量大小進(jìn)行分離216。 環(huán)狀DNA的遷移受其拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)特性的影響。分子量相同的環(huán)狀 DNA有不同的形狀，其遷移率不同： 超螺旋 線狀開環(huán)或松弛態(tài) 分離不同大小的DNAn 分子量小的 DNA（11000bp）: 用聚丙烯酰胺n 分子量大的 DNA（): 用瓊脂糖 n 大片段DNA(3050kb): 用脈沖電場(chǎng)凝膠電泳限制性內(nèi)切酶特點(diǎn)：1）特異性識(shí)別序列2）特異性切割位點(diǎn)限制酶識(shí)別序列長(zhǎng)度通常為４－６堿基對(duì) ，大多呈回文序列。限制性內(nèi)切酶圖譜：也稱DNA物理圖譜，是DNA鏈上某些限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的圖譜，可作為DNA片段的特殊標(biāo)記。是DNA特征的證據(jù)。DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜的建立識(shí)別4個(gè)核苷酸的內(nèi)切酶，在DNA鏈上出現(xiàn)機(jī)率為: 1 / 44＝1 / 256bpA、部分酶解法：n ①完全酶解 3 ，2， 1 kbn ②部分酶解 6，5，4，3，2, 1 kbn ③分析 5=3+2 4=3+1 3在中間：? 總長(zhǎng) EcoRⅠ HpaⅡ? 3kb ， ，? EcoRⅠ+ HpaⅡ ? , , , ? 分析： ? ①HpaⅡ一個(gè)切點(diǎn)，可肯定②EcoRⅠ kb不在末端，在中間③EcoRⅠ kb都在末端? ④邏輯判斷以上二片段在哪一邊末端，部分酶解法限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）的檢測(cè)在一個(gè)特定基因座位上，存在著兩個(gè)或兩個(gè)以上的等位基因，其中任何一個(gè)在人群中頻率不低于10%，這就是多態(tài)性但現(xiàn)在認(rèn)為不同個(gè)體中同一位點(diǎn)上DNA核苷酸序列產(chǎn)生變異，且在人群中發(fā)生頻率大于1%，就可認(rèn)為是多態(tài)性。如在限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)發(fā)生核苷酸的變異（或多態(tài)性），就會(huì)產(chǎn)生RFLP，除SNP外，還包括缺失、重復(fù)、插入、基因重排以及串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)的變異限制性酶切的應(yīng)用(1) 鑒定是否是需要的DNA片段(2) 建立基因組圖譜(3) 遺傳性疾病的研究和診斷n 根據(jù)多態(tài)性片段尋找與疾病相關(guān)的基因n 診 斷：? 直接檢測(cè)? 連鎖分析3. 核酸分子雜交 把親源關(guān)系較近的，不同生物個(gè)體來(lái)源的變性DNA或RNA單鏈，經(jīng)退火處理形成DNADNA或DNARNA這一過(guò)程叫分子雜交。核酸分子雜交技術(shù)的原理有互補(bǔ)特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時(shí)，其相應(yīng)同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。 如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合適標(biāo)記物（如放射性同位素、生物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe), 與變性后的單鏈基因組DNA或RNA進(jìn)行雜交。 再用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測(cè)出來(lái)，就可確定靶核苷酸序列是否存在、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等應(yīng) 用：(1)檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；(2)用來(lái)揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。 Southern 印跡雜交此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。 吸水紙轉(zhuǎn)膜：玻璃濾紙凝膠尼龍膜濾紙（厚吸水紙）玻璃板重物 Northern印跡雜交 與Southern雜交類似。檢測(cè)目的RNA的存在與否及含量。 Western印跡雜交將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體抗原”免疫反應(yīng)或“DNAprotein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。 斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交Dot blotting and slot blotting適于核酸樣品定量檢測(cè)，而不是定性檢測(cè)。 原位雜交in situ hybridization 分為菌落、噬菌斑及真核細(xì)胞原位雜交 生物芯片生物芯片（biochip）是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要是指通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速與大信息量的檢測(cè)。 生物芯片的分類(1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray)(2) 蛋白質(zhì)芯片(Protein chip)(3) 芯片實(shí)驗(yàn)室(Labonachip)基因芯片n 基因芯片：是指將大量探針?lè)肿庸潭ㄔ谖矬w表面，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和系列信息。n 它以其可同時(shí)、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)的基因組信息而顯示巨大威力。n 目前，基因芯片已經(jīng)應(yīng)用于基因表達(dá)檢測(cè)、尋找新基因、雜交測(cè)序、基因突變等許多方面。蛋白芯片：是以蛋白質(zhì)代替DNA作為檢測(cè)對(duì)象，比基因芯片更進(jìn)一步接近生命活動(dòng)的物質(zhì)層面，因而有著比基因芯片更加直接的應(yīng)用前景。 DNA芯片技術(shù)的基本原理：DNA芯片技術(shù)的基本原理是分子識(shí)別，與Southern雜交和Northern雜交同出一理，即DNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)和序列互補(bǔ)原理。 DNA芯片技術(shù)流程◆芯片方陣的構(gòu)建◆樣品制備◆生物分子反應(yīng)◆信號(hào)的檢測(cè)及分析 DNA芯片應(yīng)用 可在基因組水平進(jìn)行基因表達(dá)和發(fā)現(xiàn)研究、突變、序列測(cè)定等，已方泛應(yīng)用于基因組研究和人類疾病的診斷等多領(lǐng)域。4. 核酸體外擴(kuò)增技術(shù)PCRPCR能做什么？n PCR反應(yīng)可以在2小時(shí)內(nèi)提供大量的目標(biāo)DNA片斷n 模板DNA不需要高度純化n PCR產(chǎn)物能用于限制性內(nèi)切酶消化、測(cè)序和克隆n PCR可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至單個(gè)DNA細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定影響PCR的主要因素Template DNA Reaction buffer (Tris, KCl, Mg2+, BSA) dNTPs Primers DNA polymerasePCR反應(yīng)條件 變性、退火、延伸溫度 循環(huán)次數(shù)溫度循環(huán)參數(shù)n 模板變性溫度決定雙鏈DNA解鏈溫度n 引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量n 引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度n 循環(huán)次數(shù)常規(guī)PCR一般為25～40個(gè)周期 擴(kuò)增結(jié)束后，樣品冷卻并置4℃保存引物(1)引物設(shè)計(jì)原則① 引物長(zhǎng)度： 1530bp，常用為20bp左右。② 引物堿基：G+C含量以4555%為宜。③ 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；避免兩條引　物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體。 ④ 引物3’端的堿基，最好是G或C。⑤ 正向與反向引物的退火溫度大致相同，一般為5065 ℃ 。⑥ 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。(2) 引物Tm 反應(yīng)的退火溫度應(yīng)根據(jù)兩個(gè)Tm（一般相差24℃）折中選擇 較低的退火溫度檢查擴(kuò)增的可能性 較高的退火溫度最佳特異性(3) 引物輔助設(shè)計(jì) Primer Premier DNA 聚合酶Klenow片段Taq DNA聚合酶來(lái)源大腸桿菌水棲高溫菌（Thermus aquatics）YT1蓖株有無(wú)3’→5’外切酶活力有無(wú)最適溫度37℃ , 擴(kuò)增的產(chǎn)物并非全是目的序列，需用探針檢測(cè)74～75℃產(chǎn)率高，特異性也高。到達(dá)平臺(tái)的循環(huán)次數(shù)2030延伸片段長(zhǎng)度400bp以內(nèi)10kb以內(nèi)影響PCR特異性的因素①退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。②減短退火時(shí)間及延伸時(shí)間可以減少錯(cuò)誤引發(fā)及錯(cuò)誤延伸。③引物二聚體是最常見(jiàn)的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯(cuò)誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。④改變MgCl2(有時(shí)KCl)濃度可以改進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對(duì)Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次級(jí)結(jié)構(gòu)，例如待擴(kuò)增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，可在PCR混合物中的4dNTPs中加入7脫氮2’脫氧鳥苷5’三磷酸 (de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物代替dGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。(1）不對(duì)稱PCR 目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,∶,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。 用途：制備核酸序列測(cè)定的模板 制備雜交探針 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究(2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。3）多重PCR 是指在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)序列的反應(yīng)過(guò)程，能夠節(jié)省時(shí)間和精力.4）LPPCR（Labelled primers)利用同位素、熒光素等對(duì)ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記，用以直觀地檢測(cè)目的基因。 特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分5）錨定PCR（anchored PCR）錨定PCR：使用一條錨定引物就一條特異性引物擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA。 6）PCR固相分析法7）原位ＰＣＲ 原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still PCR，Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。 適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列原位PCR的作用 既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH），但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列，敏感度很高，但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。 ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來(lái)，成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測(cè)技術(shù)。利用該法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測(cè)細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。操作步驟： 細(xì)胞或組織的固定 PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段 原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物8）ＲＴ－ＰＣＲ定量PCR：是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過(guò)程的監(jiān)測(cè),進(jìn)行PCR起始模板量的定量。用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 實(shí)時(shí)原理 1）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 擴(kuò)增曲線2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 熒光閾值3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 Ct值4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理Ct值的重現(xiàn)性Ct值的特點(diǎn)：167。 相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；167。 Ct值則極具重現(xiàn)性Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)5）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 標(biāo)準(zhǔn)曲線q 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小q Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量6）實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 絕對(duì)定量q 確定未知樣品的 C(t)值 q 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量7) SYBR Green 法 定量原理 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量8)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 DNA 產(chǎn)物的熒光標(biāo)記實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法 1 SYBR Green 法SYBR Green法工作機(jī)理:SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位q SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光q 變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無(wú)熒光q 復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定