【正文】 2 基因間距離 5 cM 3) 可用于基因（或其他標(biāo)記）的粗略定位順序標(biāo)簽位點（STS）作圖大基因組物理作圖的主流技術(shù) 已知序列為標(biāo)簽的位點（STS)作探針，與基因組DNA雜交 繪制物理圖譜。STS的要求： 為已知序列，便于PCR檢測，基因組中僅此一個位點，無重復(fù)。STS長度一般100500bpSTS類型： ESTs (Expressed Sequence Tags)SSLPs (Simple Squence Length Polymorphism) Random Sequence? 一次測序750bp? 大片斷 小片斷 拼接 完整序列 （鳥槍法）? 復(fù)雜序列的組裝問題基因組測序的兩種方法: 克隆重疊群法 全基因組鳥槍法基因組測序 DNA測序的方法: 鏈終止法 化學(xué)降解測序十一、解讀基因組序列及基因功能研究方法１ 搜尋基因根據(jù)序列分析搜尋基因利用開放閱讀框(ORF)　排除真核生物內(nèi)含子的干擾 密碼子偏愛 外顯子－內(nèi)含子邊界 上游控制序列 同源查詢　　開放閱讀框什么是開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF） 在構(gòu)成基因的核苷酸序列中存在著一些最終翻譯成蛋白的堿基段，每三個連續(xù)堿基(即三聯(lián)“ 密碼子”） 編碼相應(yīng)的氨基酸。其中有一個起始“密碼子”AUG/ATG和三個終止“ 密碼子”，終止“ 密碼子”提供 終止信號。開放閱讀框是基因序列的一部分，包含一段可以編碼蛋白的 堿基序列。該段堿基序列編碼一個蛋白。ORF掃描方法的問題與規(guī)則問題　 每條鏈有3種可能的讀框， 2條鏈共6種　　　真核內(nèi)含子的干擾n ORF掃描方法的問題與規(guī)則　　規(guī)則(1)　內(nèi)含子的偏好性(2)外顯子－內(nèi)含子邊界　內(nèi)含子5’端常見順序5’AG GTAAGT3’　內(nèi)含子3’端常見順序5’PyPyPyPyPyPyCAG3’(Py為T或C）(3)上游調(diào)控序列(4)CpG島在基因的末端通常存在一些富含雙核苷酸“CG”的區(qū)域，稱為“CpG島”（CpG island）。 56%人類基因上游與CpG島相連。 在人類基因組內(nèi)，存在有近3萬個CpG島；在大多數(shù)染色體上，平均每100萬堿基含有5～15個CpG島，%～70%。通常，這些CpG島不僅是基因的一種標(biāo)志，而且還參與基因表達(dá)的調(diào)控和影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)同源查詢n 利用存入數(shù)據(jù)庫的基因順序與待查的基因組序列進(jìn)行比較n 不同種屬間結(jié)構(gòu)功能相似的基因具有保守性，即在進(jìn)化上具有同源性　 存在某些完全相同的序列　　ORF讀框的排列類似　　ORF指令的氨基酸順序相同　　模擬的多肽高級結(jié)構(gòu)相似實驗分析確認(rèn)基因：1）分子雜交確定是否含表達(dá)序列2）利用cDNA確定基因位置 　　cDNA與DNA比較，可以定位基因并揭示外顯子－內(nèi)含子邊界3）準(zhǔn)確定位外顯子－內(nèi)含子邊界 基因失活 基因過表達(dá) 酵母雙雜交 反義RNA RNAi干涉基因失活：同源重組造成基因滅活，即基因敲除。n 完全基因敲除 通過同源重組完全消除細(xì)胞或動物個體中的靶基因活性n 條件型基因敲除 通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除 Exp: CreLoxp系統(tǒng)216。 酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast Twohybrid System) 用途：n 快速篩選與一種已知蛋白結(jié)合的目的蛋白，發(fā)現(xiàn)新基因n 驗證 已知蛋白間的相互作用及作用強度216。 優(yōu)點：n 根據(jù)興趣蛋白的基因序列 即可篩選與其作用的目的蛋白n 蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞內(nèi)，處于天然狀態(tài)，蛋白質(zhì)之間的相互作用符合細(xì)胞內(nèi)情況，即使是兩種蛋白質(zhì)的瞬時結(jié)合也可被檢測出來n 可以直接獲得目的蛋白的基因序列，從而可以初步判斷目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。216。 局限性：n 表達(dá)的外源蛋白均為融合蛋白，可能與天然狀態(tài)不符，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確n 本身就具有轉(zhuǎn)錄激活活性 的興趣蛋白不適合于該系統(tǒng)n 不能定位于核內(nèi) 的興趣蛋白不適合于該系統(tǒng)n 需要翻譯后修飾的蛋白 不適合該系統(tǒng)反義RNA： 反義RNA是由基因的負(fù)鏈編碼,可與正義RNA (sense RNA)或DNA 編碼順序結(jié)合,干擾mRNA 的轉(zhuǎn)錄,加工和轉(zhuǎn)運,調(diào)控基因的表達(dá).n 構(gòu)建反義RNA 表達(dá)載體: 將全目的基因或部分目的基因反向插入表達(dá)載體 → 轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物 →獲得轉(zhuǎn)基因個體或品系 → 分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異 → 判別目的基因的功能n 反義RNA 作用機理：A 干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細(xì)胞降解。 B 與mRNA 的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使翻譯無法啟動。 C 反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RNA多聚酶脫離模板,轉(zhuǎn)錄終止。RNAi干涉：RNAi干涉是通過雙鏈RNA的介導(dǎo),特異性地降解相應(yīng)序列的mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制.RNAi 作用機理：A dsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成21~25 個核苷酸長的RNA鏈。B 這些小片段RNA(siRNA)作為另一個核糖核酸復(fù)合體RISC(RNAinduce silencing plex,RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的指引物,結(jié)合到RISC上,使之識別并降解mRNA,從而導(dǎo)致與雙鏈RNA同源的基因沉默。siRNA （small interfering RNAs，siRNAs）的一般設(shè)計原則：（1）從mRNA 的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其339。端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。（2）將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（3）選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列制備siRNAs的方法 ：（1）化學(xué)合成n 盡管化學(xué)合成是最貴的方法，但是卻是最方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。許多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。n 主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。n 由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。n 最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究；n 不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素（2）體外轉(zhuǎn)錄 n 相對化學(xué)合成法而言成本比較低，是一種性價比高的篩選siRNAs的好方法。n 更重要的是能夠更快的得到siRNAs。n 值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNAs較高濃度得到的效果。n 不足之處：實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。n 最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價格成為障礙時。n 不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。 （3）用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA n 其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。n 這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒”就可以避免這個缺陷。n 這個方法是選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一眾siRNAs“混合雞尾酒”。n 在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。n 由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。 （4）siRNA表達(dá)載體 216。 多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴3種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。包括的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。216。 之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。（5） siRNA表達(dá)框架 n siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。n 這個方法最早是由Castanotto采用，包括一個RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNA pol III終止位點。n 和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。n 因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配！n 如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。n 構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長效抑制的研究。 n 這個方法的主要缺點是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。如果有適合的新型轉(zhuǎn)染試劑能提高SEC的轉(zhuǎn)染效率的話，那問題就可以解決了。另外，沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規(guī)模制備。n 最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子；n 不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了） 。 轉(zhuǎn)染細(xì)胞n siRNAs需要進(jìn)入細(xì)胞后才能對蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制，因此將其高效地轉(zhuǎn)入細(xì)胞也是研究成功與否的關(guān)鍵步驟。n 例如，一個siRNA對某個特定基因表達(dá)的抑制效率是90%，但是其轉(zhuǎn)染效率只有10%，那么總的抑制率只有9%。n 目前傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法與試劑的效果都不是很理想。n 但是有專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑，其原理也是基于脂質(zhì)體技術(shù)，可用于多種真核細(xì)胞的RNAi研究。RNAi的效果分析n 可從mRNA和蛋白質(zhì)兩方面進(jìn)行。252。 mRNA：RTPCR；定量PCR；Northern 雜交等。252。 蛋白質(zhì)：Western雜交；ELISA；免疫熒光等。n 細(xì)胞的代謝過程，生理生化系數(shù)等表型參數(shù)的變化是RNAi效果最終和最大的體現(xiàn)。其他方法凝膠阻滯實驗技術(shù)：鑒定啟動子中與特異蛋白質(zhì)的結(jié)合部位、結(jié)構(gòu)特征，以及特異蛋白質(zhì)的純化與功能分析、調(diào)控效應(yīng)等.應(yīng)用cDNA差示法分析克隆基因 cDNA差示分析法（representational difference analysis, RAD）充分發(fā)揮了PCR能以指數(shù)形式擴增雙鏈DNA模板，僅以線形形式擴增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片斷?；虮磉_(dá)系列分析技術(shù)Serial analysis of gene expression, SAGE是一種以DNA序列測定為基礎(chǔ)定量分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種細(xì)胞類型或組織的基因表達(dá)信息。在轉(zhuǎn)錄組水平上，任何長度超過910個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。十二、蛋白質(zhì)純化方法 緩沖液 pKa值 溶解度 與溶液中其他成分的相互作用（如金屬離子和酶） 價格 紫外吸收值 對生物膜的通透性 選擇緩沖液的一般原則l 避免緩沖液與目標(biāo)蛋白的不良相互作用l 一般使用最低濃度以避免非特異性離子強度的影響（如50mmol/L)l pKa的變化超過1個pH單位時，其有效緩沖能力明顯降低。許多酶在極限pH時往往發(fā)生不可逆的變性。l 根據(jù)選用的分離方法選擇緩沖液： 凝膠過濾－－多數(shù)緩沖液可適用 陰離子交換層析－－陽離子交換緩沖液首選Tris緩沖液 陽離子交換、羥基磷灰石層析－－陰離子交換首選磷酸緩沖液? 純化方案的設(shè)計 首先選擇分離方法：依據(jù)目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)之間的理化性質(zhì)的差異? 先選：粗放、快速、利于縮小樣品體積和后處理的方法? 后選：精確、費時、需樣品少的方法。 影響純化的因素 a. 高活性 b. 高回收率 工序 c. 高純度 d. 方便與快速 e. 經(jīng)濟 幾種主要分離方法的比較根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法 二、蛋白質(zhì)純化步驟 材料獲得：：新鮮，含量豐富，易于提取，價格便宜。：對于天然不易得到的蛋白，通過工 程菌或工程細(xì)胞表達(dá)而獲得。 粗分離主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。 破細(xì)胞 動物，植物細(xì)胞：勻漿，研磨 大腸桿菌：凍融，超聲，溶菌酶 抽提 1. pH：選擇合適pH的緩沖液，如Tris，磷酸鹽，醋酸鹽，檸檬酸 鹽緩沖體系，保證待分離蛋白在此pH條件下穩(wěn)定。一般緩 沖液濃度為20－50mM。 ：低溫如4－10℃，蛋白酶活性較低。 ：－ M NaCl或KCl. ：還原劑如NaHSO4，維生素C；巰基保護劑DTT，巰基 乙醇；金屬螯合劑EDTA，EGTA；蛋白酶抑制劑PMSF。 初步分離 ：離心，超離心 ：酶法DNase,RNase；超聲