dna測序常見問題和分析報告(編輯修改稿)
2025-04-20 04:50 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ：重復(fù)結(jié)構(gòu)將導(dǎo)致測序復(fù)制框的滑移，重復(fù)結(jié)構(gòu)之后峰型混亂。解決辦法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該重復(fù)結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。 ？ ：(1) 菌液為非單克隆： 下圖是pGEMT載體測序的結(jié)果，在83位點(diǎn)處測序結(jié)果出現(xiàn)雙峰（插入后雙峰），即模板中含有兩個或兩個以上的相同載體，但是插入片段不同。 解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取質(zhì)粒。需要注意的是，重新進(jìn)行PCR反應(yīng)或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。(2) PCR產(chǎn)物不純，如下圖所示：在197bp前測序峰表現(xiàn)為雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一個高高的A峰，這個A峰標(biāo)志著此PCR產(chǎn)物中有一個片段大小為200bp左右的小片段。 注：PCR產(chǎn)物測序都是以A高峰終止。 解決方法：對PCR產(chǎn)物切膠純化，再進(jìn)行測序。 ？ ：以polyT為例，在polyA/T結(jié)構(gòu)之后往往出現(xiàn)移碼、雙峰、套峰現(xiàn)象，而在polyG/C之后會往往導(dǎo)致測序信號的衰減或者直接中斷。 解決辦法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該poly結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。如果是較長的PloyG/C。 ？ ：位點(diǎn)94至137是一個回文結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)導(dǎo)致后面的信號衰減，出現(xiàn)錯誤的判讀。 解決方法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該回文結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。 ？ A8. (1) 產(chǎn)物中含有小片段PCR產(chǎn)物；(2) 引物有兩個結(jié)合位點(diǎn)，其中一個結(jié)果中斷解決方法：換引物反向測序。 ？ 。：信號值（ATGC的平均值）皆小于100：測序無信號的判定： 在確認(rèn)引物、質(zhì)粒抽提濃度、反應(yīng)安排等條件無問題的情況下，測序結(jié)果峰型雜亂且信號值小于100的結(jié)果；此時則判定結(jié)果為測序無信號。兩次測序無信號，我們會取消實驗。 ： 在用特殊試劑盒（）時，會發(fā)生堿基替代，從而出現(xiàn)堿基位移的現(xiàn)象，即飄峰。 解決方法：用普通試劑盒（）測序消除堿基位移。 注：，對POlyA/T、重復(fù)結(jié)構(gòu)（GT/GA等）無效，然后用普通試劑盒進(jìn)行糾正。 A12. DNA 測序常見問題解答（FAQs）(From : HTUTU)DNA 測序常見問題解答（FAQs）Q1. DNA測序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL型測序儀測序的準(zhǔn)確度如何？Q2. 為什么在測序報告上找不到我的引物序列？ Q3. 我有一個大于2KB的PCR片段，希望你們幫我測通。 Q4. 為什么我的PCR片段為300bp，而你們發(fā)送給我的序列卻達(dá)到了700多bp？ Q5. 我的引物做PCR效果很好，為什么用于測序總得不到好的結(jié)果？ Q6. 我進(jìn)行PCR反應(yīng)時，所用的退火溫度是59℃，是否可以用該溫度對我的樣品完成測序反應(yīng)？ Q7. 我的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有多條帶，是否可以為我完成切膠純化，再進(jìn)行測序反應(yīng)？哪些情況下需要進(jìn)行切膠純化？ Q8. 我的PCR產(chǎn)物為單一條帶，但未經(jīng)純化，是否可以直接送到貴公司進(jìn)行測序？ Q9. 我的PCR產(chǎn)物電泳檢測條帶單一，為什么測序結(jié)果說模板雜？ Q10. 什么是堿基缺失？ Q11. 什么是引物不純？ Q12. 重復(fù)結(jié)構(gòu)對測序有哪些影響？ Q13. 什么是模板不單一？ Q14. poly結(jié)構(gòu)的測序結(jié)果是怎樣的？ Q15. 含有回文結(jié)構(gòu)的模板測序結(jié)果是怎樣的？Q1. DNA測序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL型測序儀測序的準(zhǔn)確度如何？答：DNA測序的原理是末端終止法。具體步驟如下： 定量：對樣品及引物進(jìn)行定量。測序反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入已定量的模板和引物，BigDye等試劑，PCR儀上完成測序反應(yīng)。讀取數(shù)據(jù)：利用測序儀讀取被測樣品的堿基序列。%。Q2. 為什么在測序報告上找不到我的引物序列？答：1） 如果您提供的是PCR樣品，在測序報告上找不到您的引物序列是正常的。這是因為測序反應(yīng)是通過對被熒光標(biāo)記的ddNTP的讀取而獲得基因序列的，而測序引物由于沒 有熒光標(biāo)記，因此自然在測序結(jié)果中就不會被識別。實際上不但測序引物無法識別，而且由于目前測序技術(shù)的局限性，緊靠測序引物一側(cè)的30～50個bp通常也無法100％識別，如果需要驗證這個區(qū)域的堿基序列或者測序引物本身的序列，就需要用另一側(cè)引物進(jìn)行反向測序。2 ）您提供的是質(zhì)?；蚓簶悠?使用通用引物測序，找不到您的PCR引物可能是因為您的PCR引物距離載體的通用引物位點(diǎn)過近，由于測序反應(yīng)在距離起始位點(diǎn)3050bp內(nèi)的結(jié)果可信度不高，因此會影響您正確讀取您的PCR引物序列。，希望你們幫我測通。答：對于片段較大的PCR樣品我們建議您將其克隆進(jìn)載體后再做測序。因為，一方面PCR產(chǎn)物的純度不是很好掌握，測序的成功率不如質(zhì)粒和菌液測序；另一方面，與PCR引物相比，一般載體上的通用引物與模板結(jié)合的能力更強(qiáng)。長度為1Kb的DNA模板需要兩個測序反應(yīng)，才有可能得到完整準(zhǔn)確的讀長，對于1kb以上的DNA片斷，在兩個反應(yīng)后還需要設(shè)計合成測序引物，測序后拼接出全長，對于這些測序引物，我們將按堿基個數(shù)收取引物合成費(fèi)用。，而你們發(fā)送給我的序列卻達(dá)到了700多bp？答：如果您查看峰圖的話，可以在您的PCR序列終止處看到一個高高的A峰，該A峰是您的PCR測序反應(yīng)的結(jié)束標(biāo)志，在此標(biāo)志之后的序列是噪音，而不是您的測序結(jié)果。因為我公司完全忠實于測序結(jié)果，不會對測序結(jié)果進(jìn)行人為修改。所以在您收到結(jié)
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1