dna測(cè)序常見問題和分析報(bào)告-資料下載頁
2025-03-24 04:50本頁面
【正文】 ：我說，您還是別用了，俺當(dāng)初是用ultraedit處理一些其它數(shù)據(jù)（當(dāng)然是word/notebook等無法勝任的數(shù)據(jù)）時(shí)，發(fā)現(xiàn)它還可以打開*.seq文件，于是就一直用過來了，沒有太多好說的吧。假設(shè)原有序列為A文件，測(cè)序結(jié)果為B文件，例如，在DNA工具軟件genetool中打開B，通過調(diào)用工具（上圖），進(jìn)入Blast程序(說這個(gè)是Blast程序有點(diǎn)牽強(qiáng)，其實(shí)是同源性比較，其實(shí)質(zhì)不就是Blast的嘛，哈哈)。加上原序列文件A之后，就直接按align all button啦這個(gè)就是比對(duì)結(jié)果：峰圖頭尾測(cè)序結(jié)果的不可靠性：頭尾的問題，很多測(cè)序公司都明確標(biāo)出了頭尾各80100bp序列的不可靠性，這是測(cè)序起始信號(hào)與終止信號(hào)不穩(wěn)定的體現(xiàn)，就如同一個(gè)跑步一樣，發(fā)力起跑與力衰止跑之時(shí)，速度是不穩(wěn)定的，無法用來衡量其跑步速度.....但俺見識(shí)過一家測(cè)序公司的測(cè)序結(jié)果，既使是頭尾區(qū)，其結(jié)果也是可信的，但總體測(cè)序長(zhǎng)度不夠長(zhǎng)，可能是用其它軟件進(jìn)行了掐頭去尾之后移花接木的處理吧！這里要強(qiáng)調(diào)一點(diǎn)的是，有時(shí)候測(cè)序公司給出的是反向測(cè)序結(jié)果，簡(jiǎn)單的align得不到匹配結(jié)果，這時(shí)，你千萬不要急著罵測(cè)序公司，試試把測(cè)序結(jié)果reverse 或reverse plement一下再進(jìn)行align，也許會(huì)有預(yù)期的結(jié)果(見過不少這樣的朋友，其實(shí)仍然只能怪我們自己^_^)這個(gè)峰是作出來的，線條有點(diǎn)粗，將就說事。第一個(gè)峰，重疊干擾。如果不判讀為干擾峰，那就說明樣品不純，如果是基因組DNA，就很好地說明了樣品為雜合子，該位點(diǎn)可能存在SNP現(xiàn)象（T/G）。如果判讀為干擾峰，我們只需認(rèn)定樣品此處堿基為T為行了。第二個(gè)峰，錯(cuò)位干擾。如果不判讀為干擾峰，則說明樣本可能比預(yù)期多一個(gè)堿基（G），如果判讀為干擾峰，我們?nèi)灾恍枵J(rèn)定樣品此處堿基為T為行了。所謂干擾，前提前件是主峰要清晰、連續(xù)，但峰圖中莫名其妙多出一條類似或接近于主峰清晰程度的峰線，但這種峰線往往是不平滑、不連續(xù)的，這是干擾峰判讀的重點(diǎn)！SNP的判讀做SNP的人不少，AFLP仍然是一種經(jīng)濟(jì)、適用的方法之一。AFLP的結(jié)果多需要用測(cè)序來進(jìn)行驗(yàn)證，但似乎以測(cè)序來驗(yàn)證結(jié)果的人并不多，或者說驗(yàn)證一二個(gè)樣本就完了，其實(shí)這樣并不科學(xué)，還是多驗(yàn)證幾個(gè)吧，證據(jù)多了，沒人會(huì)說我們少了，但證據(jù)少了，我們自己說話都沒底氣，何苦自己給自己添亂呢？前面說了干擾峰的判讀，其特征是峰線不平滑、不連續(xù)，而SNP峰圖跟主峰圖一樣，是連續(xù)的平滑峰線，且不存在錯(cuò)位！見下圖：雙峰、雜峰與亂峰、高GC片段測(cè)序：雙峰，圖形上接近于SNP峰形，但堿基無法正確判讀，通常以一連串N代表，僅有個(gè)別位置能正確判讀出堿基。對(duì)于出現(xiàn)雙峰的情況，堅(jiān)決不付費(fèi)，理由如下：如果是PCR產(chǎn)物，測(cè)序前要對(duì)PCR產(chǎn)物純化，我們一般都是讓測(cè)序公司純化，此時(shí)都指明了產(chǎn)物大小，此時(shí)如果出現(xiàn)雙峰，是測(cè)序公司的責(zé)任，要么是它沒純化好，要么是它測(cè)序前進(jìn)行的單鏈擴(kuò)增質(zhì)量不過關(guān)，而后者的可能性最大，因此，一旦出現(xiàn)雙峰，公司應(yīng)該及時(shí)終止實(shí)驗(yàn)（除非你說明要的就是雙峰）并告之客戶。如果測(cè)序樣品是質(zhì)粒，拋開我們自己質(zhì)粒抽提不純的原因不管，測(cè)序過程出現(xiàn)雙峰，公司同樣應(yīng)該終止實(shí)驗(yàn)。公司不終止實(shí)驗(yàn)而讓我們交納由他們懶惰導(dǎo)致的材料消耗而收我們的費(fèi)用，我們理應(yīng)不給費(fèi)用......關(guān)于雜峰與亂峰,這個(gè)沒太多說法，看著不順眼的dd，說它是雜峰就是雜峰說它是亂峰就是亂峰，反正就是主峰不清晰，測(cè)序之序列結(jié)果不明確或不肯定，結(jié)果沒法用。見識(shí)過雜峰仍要收費(fèi)的角兒！希望下次你們不要碰上！而對(duì)于GC高片段測(cè)序，一般測(cè)序公司有明確指出，測(cè)序結(jié)果低于300bp不收費(fèi)，但俺見過測(cè)了100多bp也要收費(fèi)的，俺也見過能測(cè)出500bp長(zhǎng)高GC含量片段的，下次撞到了，據(jù)理立爭(zhēng)！有時(shí)候，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期目的序列毫不相干，是測(cè)序公司的錯(cuò)誤還是我們自己樣品的錯(cuò)誤呢？那就從測(cè)序結(jié)果中查找測(cè)序引物吧，如果連測(cè)序引物都找不到，我們當(dāng)然把責(zé)任歸結(jié)于測(cè)序公司，如果找到了測(cè)序引物尤其是拿自己合成的引物來進(jìn)行測(cè)序的引物，兄弟們，還是乖乖掏錢并立馬重作實(shí)驗(yàn)吧......： （1）寄給公司的細(xì)菌提不出質(zhì)粒：這種現(xiàn)象不多但一個(gè)月也能撞上那么一次啦！公司用的是批量化操作，以許就那么霉，輪到俺這兒加樣槍或其它什么出了點(diǎn)問題沒挨到俺的細(xì)菌，三天后要求公司重抽吧，一般都能抽出來。 （2）測(cè)序沒信號(hào)：就俺目前的經(jīng)驗(yàn)而言，與公司技術(shù)水平、操作流程有關(guān)，有點(diǎn)和第（3）點(diǎn)類似，但要和第（4）點(diǎn)嚴(yán)格區(qū)分。 (3) 能測(cè)出頭（尾）卻測(cè)不出尾（頭）：這種現(xiàn)象不少一個(gè)月至少撞上一次。好在自己還沒遇到個(gè)N個(gè)公司都測(cè)不通的樣品，這個(gè)公司不行，總有一個(gè)公司行！A公司測(cè)不來B公司卻能測(cè)出來，能說明什么？反正不是我們樣品的錯(cuò)。沒經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候，把樣品送到另外一個(gè)公司重測(cè)，現(xiàn)在不了，把樣品送到其他公司后只測(cè)沒測(cè)出來的那一端，兩方面的結(jié)果一拼，同樣可以確定測(cè)序結(jié)果。 (4)特殊樣品的測(cè)序：如RNA干擾載體、病毒載體，這樣的樣品，測(cè)不出來不要怪公司，只能找更好的公司去測(cè)。而對(duì)于有的樣品，是需要自己特殊處理才能測(cè)出來的，記得有位朋友一個(gè)樣本測(cè)了4個(gè)月才測(cè)出來，而另外一位朋友的樣本，現(xiàn)在測(cè)出來沒有也不清楚，至少有三個(gè)月了吧....歡迎您的光臨，！希望您提出您寶貴的意見，你的意見是我進(jìn)步的動(dòng)力。贈(zèng)語； 如果我們做與不做都會(huì)有人笑，如果做不好與做得好還會(huì)有人笑，那么我們索性就做得更好，來給人笑吧！ 現(xiàn)在你不玩命的學(xué)，以后命玩你。我不知道年少輕狂，我只知道勝者為王。不要做金錢、權(quán)利的奴隸；應(yīng)學(xué)會(huì)做“金錢、權(quán)利”的主人。什么時(shí)候離光明最近？那就是你覺得黑暗太黑的時(shí)候。最值得欣賞的風(fēng)景，是自己奮斗的足跡。壓力不是有人比你努力，而是那些比你牛幾倍的人依然比你努力。學(xué)習(xí)資料
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