生工測序問題分析-資料下載頁
2025-01-09 02:46本頁面
【正文】 突變可靠嗎？ 有的客戶想用測序的方法檢測點突變體，我認為該方法可靠性不高。主要有以下兩個原因。首先，我們并不清楚突變的序列與正常的序列的比例是多少。測序反應的信號強度直接與模板的量有關，如果突變的模板所占的比例很少，將直接作為背景噪音了，很難檢測出來。只有當測序反應體系中正常的和突變的模板量比較接近時，才能較可靠地檢測到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號強渡一般是不一樣的。這樣即使突變的模板所占的比較較高時，也不一定能準確檢測 到突變的存在。另外，測序儀是設計用來測序正常的堿基序列的，軟件在對掃描的結果進行處理時，會盡量提高主峰而將背景信號盡量壓低，以得到盡可能好的結果。因此，當某處出現(xiàn)雙峰時，測序儀一般會認為信號弱的峰為背景信號，在處理過程中，將弱的峰進一步壓低，這樣根部不立于突變體的檢測。因此認為，用測序的方法檢測突變體的存在不是一個好的方法。 與測序引物有關的問題： 對于通用測序引物，只要正確使用，一般不會有太大問題，測序引物問題主要發(fā)生在客戶自己提供的 PCR 引物上。應該明確的一點是并不是所用的用于 PCR 的引物都可以用來作測 序， 以下幾種 PCR 引物將是不適合用作測序引物的： 簡并引物， 簡并引物必然要在測序模板上有多個結合位點，直接影響測序結果。 隨機引物，如 RAPD 引物， 隨機引物一般都比較短，所用退火溫度低，在測序反應的條件下，不能很好地與模板結合。 過長的引物，一般要求測序引物不大于 24bp，最長不能超過 30bp。 過長的引物在測序反應的較低的條件下容易在測序模板上有多個結合位點，導致測序結果背景增高。另外，較長的引物純度也將難以保證。通常用于測序的引物純度要在 90%以上，引物純度低時，測序反應的背景將明顯增大，直接影響到 測序結果。 有特殊標記的引物， 該情況主要指熒光標記的引物。我們測序反應的四種堿基都是熒光標記的，這樣，熒光標記的引物將產生干擾。另外，其他一些有大的標記基團的引物也最好不要用于測序。引物上大的標記基團將直接影響到 DNA 片段的遷移率，導致測序結果峰型不好或錯誤。 不純的引物： 測序引物對純度的要求很高，合成的引物中非全長的片段可以造成較強的背景。以一個 20bp 的測序引物為例，直接脫鹽純化的話，純度至多在 70%左右，也就是說將有 30%的引物將作為背景噪音，這必將嚴重影響測序結果。一般經(jīng) PAGE 或 OPC 法純化的 引物基本能達到測序的要求。 造成測序反應模板量低主要有以下幾種原因： 客戶提供的 PCR 產物量太少，經(jīng)純化后不足以滿足測序需要。 一些低拷貝的質粒按照常規(guī)方法提取，所得質粒很少，經(jīng)濃縮后仍然很少。 客戶提供的 PCR 產物或質粒的量很少是我們測序反應中經(jīng)常遇到的一個問題。為解決該問題，我們在平時收客戶模板的過程中需要注意如下事項： 質粒類型的測序模板盡量讓客戶提供菌液，不要直接提供質粒。菌液我們可以控制模板提取的量和質量。而且，所提供的質粒類型一般應為高拷貝的。以下幾種質粒是我們測序成功率非常高的，包括 pGEMT 載體， pUC 及其衍生載體等。 對于 PCR 類型的測序模板，未純化的 PCR 產物要保證足夠的量，一般我們要求客戶提供 50~100 uL 的 PCR 擴增產物，并且要求 PCR 擴增的質量要高。有雜帶的 PCR 擴增產物我們盡量不要收。對于純化的 PCR 產物，要保證足夠的量，通常要求客戶對已純化的 PCR 產物用電泳進行檢測。一般來說，對于一個 1kb 長的純化 PCR 產物進行測序，客戶提供的 PCR 產物量不應低于 200ng。另外，用分光光度法進行的 PCR 產物定量是極不可靠的。對于未純化的 PCR 產物，提供的量應至少為已純化的 PCR 產物的量的 2 倍。 另外， PCR 產物測序客戶需提供相應的 PCR 擴增引物用于測序。引物最好稀釋成 5 uM 的濃度，總體積不低于 20 uL。 最后一點是，我們應該明確，并不是所有的測序樣品都能測出滿意的序列。根據(jù)我們的統(tǒng)計并參考其他公司的情況，一般會有 10%到 15%的序列是難以測出的。對于大部分未測出的序列，我們可以找到盡可能的原因，以建議客戶下一步如何做
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