生工測序問題分析-資料下載頁
2025-01-09 02:46本頁面
【正文】 突變可靠嗎？ 有的客戶想用測序的方法檢測點突變體，我認(rèn)為該方法可靠性不高。主要有以下兩個原因。首先，我們并不清楚突變的序列與正常的序列的比例是多少。測序反應(yīng)的信號強度直接與模板的量有關(guān)，如果突變的模板所占的比例很少，將直接作為背景噪音了，很難檢測出來。只有當(dāng)測序反應(yīng)體系中正常的和突變的模板量比較接近時，才能較可靠地檢測到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號強渡一般是不一樣的。這樣即使突變的模板所占的比較較高時，也不一定能準(zhǔn)確檢測 到突變的存在。另外，測序儀是設(shè)計用來測序正常的堿基序列的，軟件在對掃描的結(jié)果進行處理時，會盡量提高主峰而將背景信號盡量壓低，以得到盡可能好的結(jié)果。因此，當(dāng)某處出現(xiàn)雙峰時，測序儀一般會認(rèn)為信號弱的峰為背景信號，在處理過程中，將弱的峰進一步壓低，這樣根部不立于突變體的檢測。因此認(rèn)為，用測序的方法檢測突變體的存在不是一個好的方法。 與測序引物有關(guān)的問題： 對于通用測序引物，只要正確使用，一般不會有太大問題，測序引物問題主要發(fā)生在客戶自己提供的 PCR 引物上。應(yīng)該明確的一點是并不是所用的用于 PCR 的引物都可以用來作測 序， 以下幾種 PCR 引物將是不適合用作測序引物的： 簡并引物， 簡并引物必然要在測序模板上有多個結(jié)合位點，直接影響測序結(jié)果。 隨機引物，如 RAPD 引物， 隨機引物一般都比較短，所用退火溫度低，在測序反應(yīng)的條件下，不能很好地與模板結(jié)合。 過長的引物，一般要求測序引物不大于 24bp，最長不能超過 30bp。 過長的引物在測序反應(yīng)的較低的條件下容易在測序模板上有多個結(jié)合位點，導(dǎo)致測序結(jié)果背景增高。另外，較長的引物純度也將難以保證。通常用于測序的引物純度要在 90%以上，引物純度低時，測序反應(yīng)的背景將明顯增大，直接影響到 測序結(jié)果。 有特殊標(biāo)記的引物， 該情況主要指熒光標(biāo)記的引物。我們測序反應(yīng)的四種堿基都是熒光標(biāo)記的，這樣，熒光標(biāo)記的引物將產(chǎn)生干擾。另外，其他一些有大的標(biāo)記基團的引物也最好不要用于測序。引物上大的標(biāo)記基團將直接影響到 DNA 片段的遷移率，導(dǎo)致測序結(jié)果峰型不好或錯誤。 不純的引物： 測序引物對純度的要求很高，合成的引物中非全長的片段可以造成較強的背景。以一個 20bp 的測序引物為例，直接脫鹽純化的話，純度至多在 70%左右，也就是說將有 30%的引物將作為背景噪音，這必將嚴(yán)重影響測序結(jié)果。一般經(jīng) PAGE 或 OPC 法純化的 引物基本能達到測序的要求。 造成測序反應(yīng)模板量低主要有以下幾種原因： 客戶提供的 PCR 產(chǎn)物量太少，經(jīng)純化后不足以滿足測序需要。 一些低拷貝的質(zhì)粒按照常規(guī)方法提取，所得質(zhì)粒很少，經(jīng)濃縮后仍然很少。 客戶提供的 PCR 產(chǎn)物或質(zhì)粒的量很少是我們測序反應(yīng)中經(jīng)常遇到的一個問題。為解決該問題，我們在平時收客戶模板的過程中需要注意如下事項： 質(zhì)粒類型的測序模板盡量讓客戶提供菌液，不要直接提供質(zhì)粒。菌液我們可以控制模板提取的量和質(zhì)量。而且，所提供的質(zhì)粒類型一般應(yīng)為高拷貝的。以下幾種質(zhì)粒是我們測序成功率非常高的，包括 pGEMT 載體， pUC 及其衍生載體等。 對于 PCR 類型的測序模板，未純化的 PCR 產(chǎn)物要保證足夠的量，一般我們要求客戶提供 50~100 uL 的 PCR 擴增產(chǎn)物，并且要求 PCR 擴增的質(zhì)量要高。有雜帶的 PCR 擴增產(chǎn)物我們盡量不要收。對于純化的 PCR 產(chǎn)物，要保證足夠的量，通常要求客戶對已純化的 PCR 產(chǎn)物用電泳進行檢測。一般來說，對于一個 1kb 長的純化 PCR 產(chǎn)物進行測序，客戶提供的 PCR 產(chǎn)物量不應(yīng)低于 200ng。另外，用分光光度法進行的 PCR 產(chǎn)物定量是極不可靠的。對于未純化的 PCR 產(chǎn)物，提供的量應(yīng)至少為已純化的 PCR 產(chǎn)物的量的 2 倍。 另外， PCR 產(chǎn)物測序客戶需提供相應(yīng)的 PCR 擴增引物用于測序。引物最好稀釋成 5 uM 的濃度，總體積不低于 20 uL。 最后一點是，我們應(yīng)該明確，并不是所有的測序樣品都能測出滿意的序列。根據(jù)我們的統(tǒng)計并參考其他公司的情況，一般會有 10%到 15%的序列是難以測出的。對于大部分未測出的序列，我們可以找到盡可能的原因，以建議客戶下一步如何做
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