生工測序問題分析(編輯修改稿)
2025-02-05 02:46 本頁面
【文章內容簡介】 不當 自帶質?；蛞鸭兓?PCR 產物量極低 是否為電泳法定量， 質粒：電泳檢測濃度大于 100ng/ul，體積大于 20ul。 測 OD值法不可靠 ,電泳檢測 總量是否足夠 已純化 PCR 產物：根據片段長度提供足夠量的模板，一 般要求是 100ng/反應 /Kb，進行多個反應的應相應增加量。 測序出現(xiàn)雙峰或信號中斷 雙峰 重復序列，如polyT、polyA 或幾個堿基重復 用反向引物測互補鏈。 此類問題主要與樣品有關 質粒測序在插入序列中出現(xiàn)套峰 可能是樣品非單克隆，挑其他克隆測序。 PCR 產物測序中，可能是存在移碼突變，這是正常的，也可以克隆后測序。 某一點后序列變亂 PCR 產物中一個或多個位置有套峰 序列中存在突變，這是正常的，也可以克隆后進行測序。 PCR 產物測序前部分雙峰 引物二聚體污染或產物不 純，克隆后測序。 質粒測序時整個結果雙峰 引物特異性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物測序。 質粒和PCR 產物測序出現(xiàn)雙峰 引物不純，測序時只要單一引物，請不要將雙向 PCR 引物混合；合成的引物沒有純化，或純化不好。重新合成引物測序。 信號迅速衰減或中斷 模板 GC二級結構區(qū)后 難以得到好的測序結果，亞克隆成較小的片段進行測序 模板 GT二級結構區(qū)后 測反向互補序列， AC 結構不影響測序 嚴重的重復結構 測反向互補序列 模板特性決定的 根據具體情況決定 信號極弱或無信號 模板質量差 重新提供菌液或純化 PCR 產物 質粒樣品：引物不符 盡量提供載體詳細信息，核查引物 引物不適宜測序 測序引物比 PCR 引物要求高，隨機引物和簡并引物不能用于測序，較長的 PCR引物也不能用于測序。重新設計引物測序，對 PCR 產物而言建議克隆到載體上用通用引物進行測序 質粒產 客戶自己提供 2ug 純化好的質粒 量極低 PCR 產物定量極低 重新電泳檢測已純化的 PCR 產物，確認有足夠的量，或提供 PCR 原液由公司進行純化 測序結果正常，與預期不符 找不到引物 質粒模板 檢測是否為空載體，從其互補鏈上尋找，克隆位點離測序引物太近，長插入片段未測通。 PCR 模板 不可能找到所用的測序引物，短片段可以從互補鏈上找到另一段的引物，長片段由于測不通，無法找到相應序列想得到全序列，短片段可以從兩端進行測序，長片段需要經克隆后進行測序。 結果完全不對 請?zhí)峁┰敿氋Y料我們會根據結果具體分析。 測序常見問題分析 序列中出現(xiàn) N 值的常見原因： 通常有以下幾種情況將造成測序結果中 N 值較多： ? PCR 產物直接進行測序，在 PCR 產物長度以后將無反應信號，機器將產生許多 N 值。通常我們很容易辨別 PCR 產物結束的位點， PCR 產物測序一般末端的一個堿基為 A（綠色峰），這是由于 Taq 酶能夠在 PCR 反應的末端非特異性地加上一個 A 堿基，我們用 T 載體克隆 PCR 產物就是根據該原理的。在最后一個堿基 A 后，信號會迅速減弱。因此我們要根據序列正確判斷出 PCR產物的末端序列，在此序列以外就不是我們所要的序列了。 ? 在序列的起始端有時會有一些 N 值。該種情況主要是有未去除的染料單體造成的干擾峰。該干擾峰和正常序列峰重疊在一起，有時機器將無法正確判斷出為何 堿基。有時，在序列的起始端的小片段容易丟失，導致起始區(qū)信號過低，機器有時也無法正確判讀?，F(xiàn)在公司已采取了有效措施，序列起始區(qū)的信號已大為改善，有時幾乎第一個堿基就可以正確讀出，染料的干擾問題基本解決。但是客戶提供的 PCR 引物用于測序時，有時會產生引物二聚體，對測序的起始區(qū)造成干擾。 ? 在序列的
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