理學酶工程ppt課件(編輯修改稿)
2025-03-20 22:20 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 電荷差別，電泳時蛋白質(zhì)向正極移動。因而其遷移率僅反映蛋白質(zhì)分子大小，故廣泛用于 蛋白質(zhì)分子量的測定 。 一維電泳 2022/3/13 37 支持物：聚丙烯酰胺凝膠。具有分子篩的作用。 凝膠的孔隙大小通過適宜的濃度和加入交聯(lián)劑（亞甲基雙丙烯酰胺）加以控制 2022/3/13 38 電泳條帶 2022/3/13 39 水平板式電泳槽 2022/3/13 40 ? PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng) ， 分為 連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng) 兩大類 ， ? 連續(xù)系統(tǒng) 電泳體系中緩沖液 pH值及凝膠濃度相同 ， 帶電顆粒在電場作用下 ， 主要靠電荷和分子篩效應(yīng) 。 ? 不連續(xù)系統(tǒng) 中由于 緩沖液離子成分 ， pH， 凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性 ， 帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng) ， 分子篩效應(yīng) ， 還具有濃縮效應(yīng) ， 因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳 。 2022/3/13 41 ? 濃度梯度凝膠電泳 從凝膠頂部到底部丙烯酰胺的濃度呈梯度變化，如通常頂部凝膠濃度為 5％，底部凝膠濃度為 25％。 ? 梯度凝膠比單一濃度凝膠的分離范圍更寬，可以同時分離較大范圍分子量的蛋白質(zhì)。 ? 另一個優(yōu)點是梯度凝膠可以分辨分子量相差較小，在單一濃度凝膠中不能分辨的蛋白質(zhì)。 2022/3/13 42 等 電 聚 焦 電 泳 IEFE Isoelectric Focusing Electrophoresis ? IEFE一種利用具有 pH梯度的支持介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。 ? 各種蛋白質(zhì)各自都有一個等電點 ,在一特殊的 pH環(huán)境中 ,蛋白質(zhì)分子呈電中性 ,在電場中不會遷移。 ? 等電聚焦 就是在電泳介質(zhì)中放入 載體兩性電解質(zhì) ，當通以直流電時，兩性電解質(zhì)即形成一個由 陽極到陰極逐步增加的 pH梯度 ，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動到或聚焦于其相當?shù)牡入婞c位置上，也就是說被聚焦于一個狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點聚焦也稱為聚焦電泳。 2022/3/13 44 常用支持介質(zhì) ：瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠，其中聚丙烯酰胺凝膠最常用 載體兩性電解質(zhì) :一系列 脂肪族多氨基多羧酸 同系物和異構(gòu)體，具有很多既不相同又十分接近相互連接的 pI值。在外電場作用下，自然形成pH梯度，是一種特殊的緩沖液。 pH范圍： pH3~10 丙烯酸 +多乙烯多胺 →→→ Ampholine（ LKB） 加成反應(yīng) 2022/3/13 45 ㈠ 沒通電時的變化 所有的載體兩性電解質(zhì)分子都荷電 ， 只是溶液中荷正電和荷負電的基團數(shù)目相等 ， 凈電荷為零 。 2022/3/13 46 ㈡ 引入電場時的變化 載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移 ， 帶有最低等電點的分子 （ 荷最多的負電 ） 將最快地向陽極遷移 。 當它達到凈電荷是零的位置時才停止 。 其次一些低 pI的載體兩性電解質(zhì)分子 （ 荷其次多的負電 ） 也將向陽極移動 ， 直到它的凈電荷被減少到零才停止 。 2022/3/13 48 ㈢ 電泳結(jié)束后的變化 所有的載體兩性電解質(zhì)分子以增加 pI級數(shù)的辦法將分別在陽、陰極之間到達它們自己的位置而給出一個 pI梯度。 蛋白質(zhì)在此 pH梯度凝膠中泳動，當遷移至 pH值等于 pI處時，就不再泳動，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。 2022/3/13 49 2022/3/13 50 ? 雙向電泳 （ twodimensional electrophoresis）是 等電聚焦電泳 和SDSPAGE的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照 pI分離），然后再進行SDSPAGE（按照分子大?。?，經(jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖。 2022/3/13 51 ㈠ 什么是固定化酶？ 水溶性酶（細胞） 水不溶性載體 水不溶性酶或細胞 （固定化酶或細胞） 固定化技術(shù) 二、固定化酶及固定化細胞 —— 固定化技術(shù) 及應(yīng)用 2022/3/13 52 酶在使用過程中 ： 2. 只能在水溶液中催化底物反應(yīng) 起難回收 固定化酶： ，利于連續(xù)自動化生產(chǎn) 缺點： 固定化過程中有時會引起酶的失活 2022/3/13 53 細胞的固定化方法 固定化細胞是在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。是 將完整細胞固定 在載體上的技術(shù) : ? (1)它免去了破碎細胞提取酶等步驟，直接利用細胞內(nèi)的酶， ? (2)固定后酶活基本沒有損失。 ? (3)細胞生長快、而且多、反應(yīng)快。 ? (4)保持酶在細胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對污染因子的抵抗力增加。 2022/3/13 54 —— 利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定化的方法 （二）固定化方法 吸附法 包埋法 結(jié)合法 交聯(lián)法 分
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