【文章內(nèi)容簡介】 點是由于攪拌槳產(chǎn)生的剪切力較大，界面引起固定化酶的破壞。 47 （ 2）連續(xù)填充床反應(yīng)器 （ continuous packedbed reactor \plugflow reactor PFR ）： 這種反應(yīng)器的使用最普遍，迄今已發(fā)表的固定化酶反應(yīng)器的研究工作主要集中在填充床反應(yīng)器。固定化酶通?？梢愿鞣N形狀，如球形，碎片、碟形、薄片，丸粒等填充于床層內(nèi)。它所使用的載體有多孔玻璃珠，珠狀離子交換樹脂，聚丙烯酰胺凝膠。二乙胺乙基萄聚糖凝膠，膠原蛋白薄膜片等。 48 填充床反應(yīng)器內(nèi)流體的流動形態(tài)接近于平推流（又稱活塞流），所以填充床反應(yīng)器可近似認(rèn)為是一種平推流反應(yīng)器（ plugflow reactor PFR）。 這種反應(yīng)器運轉(zhuǎn)時，底物按照一定的方向以恒定流速通過反應(yīng)床。根據(jù)底物的流動方式，又有下向流動，上向流動和循環(huán)流動之分。工業(yè)生產(chǎn)中，液流方向常用上向方式，這樣可以避免下向流動的液壓對恒床的影響，尤其對生產(chǎn)氣體的反應(yīng)更為重要。 49 （ 3）流化床反應(yīng)器 （ fluidizedbed reactor FBR）：在流化床反應(yīng)器內(nèi)，底物溶液以足夠大的流速向上通過固定化酶床層，使固體顆粒處于流化狀態(tài)，達到混合目的。流速應(yīng)能使酶顆粒不下沉，又不致使顆粒溢出反應(yīng)床為宜。該反應(yīng)器混合程度高、傳熱傳質(zhì)效果良好，可用于處理黏性強和含有固體顆粒的底物。 （ 4）循環(huán)反應(yīng)器 (recycle reactor,RCR):這種反應(yīng)器是讓部分反應(yīng)液流出，和新加入的底物流入液混合，再進入反應(yīng)床進行循環(huán)。其特點是可提高液體的流速和減少底物向固定化酶表面?zhèn)鬟f的阻力，可達到較高的轉(zhuǎn)化率。當(dāng)反應(yīng)底物是不溶性物質(zhì)時，可采用循環(huán)反應(yīng)器。 50 （ 5）連續(xù)流動攪拌罐 超濾膜反應(yīng)器 （ bined CSTR/UF reactor） :由連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器和超濾裝置組合而成的反應(yīng)器，它是在連續(xù)攪拌反應(yīng)罐的出口處裝有一半性的超濾膜，該膜只允許產(chǎn)物和未曾反應(yīng)的底物通過，而分子量相對較大的酶則被截留，可使酶反復(fù)使用。 51 （ a)間歇式攪拌罐反應(yīng)器 （ Batchfed stirredtank reactor, BSTR）： (b)連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器 （ Continuous stirredtank reactor CSTR）： (c)連續(xù)流動攪拌罐 超濾膜反應(yīng)器 （ bined CSTR/UF reactor） :(d)填充床反應(yīng)器 （ packedbed reactor \plugflow reactor PFR ）； (e)循環(huán)反應(yīng)器 (recycle reactor,RCR):(f)流化床反應(yīng)器 （ fluidizedbed reactor FBR） 52 二、酶反應(yīng)器的選擇與設(shè)計原則 雖然目前有多種不同類型的反應(yīng)器可供使用，但并沒有一種通用的理想的反應(yīng)器，在研究和生產(chǎn)中，必須根據(jù)具體的情況來選擇合適的反應(yīng)器。 根據(jù)固定化酶的形狀來選擇。一般顆粒狀和片狀的固定化酶對連續(xù)流攪拌罐反應(yīng)器 (CSTR)和填充床反應(yīng)器（ FBR） 都適用。如果固定化酶容易變形、易粘連或顆粒細(xì)小時，采用 FBR較為適宜。 根據(jù)底物的物理性質(zhì)來選擇。溶解性好的或乳濁液底物對任何類型反應(yīng)器都適用，但顆粒狀或膠狀底物往往會堵塞填充床，需要采用高流速攪拌的 CSTR。 53 根據(jù)酶反應(yīng)動力學(xué)特性來選擇。填充床反應(yīng)器在固定化酶反應(yīng)器中占主導(dǎo)地位，它適用于產(chǎn)物對酶具有抑制作用的反應(yīng)，若底物對酶具有抑制作用時， CSTR所受的影響要比流化床反應(yīng)器（ FBR） 少些。 根據(jù)外界環(huán)境對酶的穩(wěn)定性的影響來選擇。 根據(jù)操作要求及反應(yīng)器費用來選擇。 54 三、酶反應(yīng)器的性能評價 酶反應(yīng)器的評價應(yīng)盡可能在模擬原生產(chǎn)條件下進行，需要測定的主要參數(shù)有： 空時、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度 。 空時 是指底物在反應(yīng)器中的停留時間，數(shù)值上等于反應(yīng)器體積與底物體積流速之比，又常稱為 稀釋率 。當(dāng)?shù)孜锘虍a(chǎn)物不穩(wěn)定或容易產(chǎn)生副產(chǎn)物時，應(yīng)使用高活性酶，并盡可能縮短反應(yīng)物在反應(yīng)器內(nèi)的停留時間。 55 轉(zhuǎn)化率 是指每克底物中有多少被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。設(shè)計時應(yīng)考慮盡可能利用最少的原料得到最多的產(chǎn)物。 酶反應(yīng)器的 生產(chǎn)強度 以每小時每升反應(yīng)器體積所生產(chǎn)的產(chǎn)品克數(shù)表示，主要取決于酶的特性、濃度及反應(yīng)器特性、操作方法等。使用高酶濃度及減小停留時間有利于生產(chǎn)強度的提高，但并不是酶濃度越高越好、停留時間越短越好，這樣會造成經(jīng)濟上的浪費。 56 第四節(jié) 固定化實例 一、 DEAESephadex A25吸附的氨基酰化酶 米曲（ Aspergillus oryzae） 3042擴大曲經(jīng) 4050h培養(yǎng)后，曲種以 6倍重量冷蒸餾水分二次抽提，白細(xì)布過濾，濾液離心取亮黃色上清液，清液中水解乙醛 DL丙氨酸活力約為 25μmol/() 。 將酶液調(diào)節(jié)至 。 再將充分溶脹并經(jīng) 洗滌的 DEAESephadex A25加至酶液中，其比例為每60ml酶液加 1g濕重的 DEAESephadexA25,混勻后置冷庫中攪拌過夜。次日吸去上層溶液，再用蒸餾水及，最后用水洗滌，4℃ 貯存?zhèn)溆??；盍厥章?50%60%，其水解乙酰 DL丙氨酸活力為 600800μmol/L （ ）。 57 二、卡拉膠包埋法制備固定化黃色短桿菌（含延胡索酸酶） 將 8kg 黃色短桿菌懸浮于 8L 45℃ 生理鹽水中；另取 34L生理鹽水中，兩者于 50℃混勻，再加 %聚乙烯酰亞胺 4L， 混勻，分裝于搪瓷盤中使成 34cm厚度，冷卻至 10℃30 min,浸泡于,切成 ，于 %豬膽汁酸溶液中（ ,含 1mol/L富馬酸） 1820h,即得延胡索酸塊，活力回收率 70%左右，用于生產(chǎn) L蘋果酸，于 37℃ 操作，使用適當(dāng)情況下，連續(xù)轉(zhuǎn)化 1年以上，活力不減失。 58 卡拉膠包埋法固定 片。 A：包埋 ； B：連續(xù)運轉(zhuǎn) 88天后。 59 三 、 青霉素?；傅墓潭ɑ? 抗生素青霉素的衍生物的合成均是 6APA作為基本的原料 。 而 6APA是通過青霉素 G或青霉素 V經(jīng)青霉素酰化酶的作用 ， 水解除去側(cè)鏈而得的產(chǎn)物 。 青霉素酰化酶則是通過細(xì)菌培養(yǎng)后經(jīng)細(xì)胞固定化而得的產(chǎn)品用于抗生素的生產(chǎn)工藝 。 具體操作如下： (1) 大腸桿菌培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)基為普通肉汁瓊脂培養(yǎng)基 ， 發(fā)酵培養(yǎng)基的成份為蛋白胨 2%。 NaCl %， 苯乙酸 %， 自來水配制 。 用 2mol/L NaOH溶液調(diào)， 在 30min后備用 。 在250ml三角燒瓶中加入發(fā)酵培養(yǎng)液 30ml， 將斜面接種后培養(yǎng) 1830h的 （ 產(chǎn)青霉素?；?） ， 用15ml無菌水制成菌細(xì)胞懸液 ， 60 取 1mol懸浮液接種至裝有 30ml發(fā)酵培養(yǎng)基的三角燒瓶中 ， 在搖床上 28℃ ， 170r/min振蕩培養(yǎng) 15h， 如此依次擴培養(yǎng) ， 直至 1000~2022L規(guī)模通氣攪拌培養(yǎng) 。培養(yǎng)結(jié)束后用高速管式離心機離心收集菌體 ， 備用 。 (2) 100kg， 置于 40℃ 反應(yīng)罐中 ， 在攪拌下加入 50L10%明膠溶液 ， 攪拌均勻后加 2%戊二醛5L， 再轉(zhuǎn)移至搪瓷盤中 ， 使之成為 3~5cm厚的液層 ，室溫放置 2h， 再轉(zhuǎn)移至 4℃ 冷庫過夜 ， 待形成固體凝膠塊后 ， 通過粉碎和過篩 ， 使其成為直徑為 2mm左右的顆粒狀固定 細(xì)胞 ， 用蒸餾水及,， 抽干 ，備用 。 61 把上述制得的固定化 （ 產(chǎn)青霉素酰化酶 ）裝填于帶保溫夾套的床式反應(yīng)器中 ， 就可連續(xù)循環(huán)轉(zhuǎn)化 PG或 PV成 6APA。 62 第五節(jié) 酶工程研究新技術(shù) 酶工程 新技術(shù) 酶 基因工程 酶的 化學(xué)修飾 酶 蛋白質(zhì)工程 （突變酶） 酶分子 定向進化 抗體酶 63 一、酶的基因工程 DNA重組技術(shù)對酶工程的滲透，導(dǎo)致了酶工程產(chǎn)業(yè)質(zhì)的飛躍，一批重要的工業(yè)用酶實現(xiàn)了基因克隆與高效表達，為新酶種的開發(fā)和酶產(chǎn)量的提高，開辟了新的有效途徑。 64 （一）、重要工業(yè)酶制劑的基因工程 在酶制劑的基因工程研究中， α 淀粉酶的研究最活躍，美國、日本、瑞士等國都已成功地實現(xiàn)了 α 淀粉酶的克隆與表達，菌株產(chǎn)酶能力提高了 35倍。美國 CPC國際公司的 Moffet研究中心已獲得 FDA的批準(zhǔn)，可用其研制的基因工程菌生產(chǎn) α 淀粉酶。這是第一個由 FDA批準(zhǔn)用基因工程菌生產(chǎn)的酶制劑。 65 日本科學(xué)家將嗜熱脂肪芽孢桿菌的中性蛋白酶基因克隆到一個不產(chǎn)酶的突變株中，將質(zhì)粒重組，