【正文】 22 吸附法的 優(yōu)點(diǎn) ：操作簡單，可選用帶不同電荷和不同形狀的載體，固定化過程可以與純化過程同時(shí)實(shí)現(xiàn)，酶失活后載體仍可再生。 用于物理吸附法的載體有高嶺土、磷酸鈣凝膠、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、羥基磷灰石、纖維素、膠原、淀粉等。 16 固定化過程中選用的載體或基質(zhì)需符合如下條件： （ 1）固定化過程不引起酶變性； （ 2）對酸堿度有一定耐受性； （ 3）有一定機(jī)械強(qiáng)度； （ 4）有一定親水性及良好穩(wěn)定性； （ 5）有一定疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒均勻； （ 6）共價(jià)結(jié)合時(shí)具有可活化基團(tuán)； （ 7）有耐受酶及微生物能力； （ 8）廉價(jià)易得。酶的催化活性主要依賴于它的特殊的高級結(jié)構(gòu) —— 活性中心。 15 三、固定化載體或基質(zhì)需符合的條件 酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。 14 由于固定化細(xì)胞除了具有固定化酶特點(diǎn)外 ，還具有其自身特點(diǎn) ， 故其應(yīng)用更為普遍 ， 它對傳統(tǒng)發(fā)酵工藝技術(shù)的改造具有極重要的影響 。 其應(yīng)用較固定化酶更為普遍 。如每公斤葡萄糖異構(gòu)酶干粉固定化后可生產(chǎn) 葡糖，較相同數(shù)量天然酶高 20倍； （ 6）轉(zhuǎn)化反應(yīng)基本無三廢排出，因此稱之為“ 無公害酶 ” 12 二、固定化細(xì)胞及其特征 固定化細(xì)胞 （ Immobilized cell） 是指被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞 ， 與固定化酶一起統(tǒng)稱為固定化生物催化劑 。 廣義的固定化酶包括 固定化酶 和 固定化細(xì)胞 兩類 。 一、固定化酶及其特征 固定化酶 （ Immobilized enzyme） 指通過物理和化學(xué)的方法將酶束縛在一定空間內(nèi)且仍具有催化活性的酶制劑 。 9 第二節(jié) 固定化生物催化劑 固定化技術(shù)是現(xiàn)代酶工程技術(shù)的重要內(nèi)容，它是克服一些天然酶在工業(yè)應(yīng)用方面的不足之處而又發(fā)揮酶反應(yīng)特點(diǎn)的突破性技術(shù)。 8 進(jìn)入 20世紀(jì) 80年代，由于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)及細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展與滲透，酶工程的發(fā)展又產(chǎn)生了一次新的飛躍，并成為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分。例如，固定化 葡萄糖異構(gòu)酶 生產(chǎn)高果糖漿，固定化 青霉素酰化酶 生產(chǎn)6氨基青霉烷酸，固定化微生物細(xì)胞生產(chǎn) L天冬氨酸和 L蘋果酸等。為了克服這些缺點(diǎn)，延長酶的使用壽命，提高酶的催化活性，并使其能在生化反應(yīng)器中反復(fù)連續(xù)使用，人們發(fā)展了固定化酶技術(shù)。 5 三、酶工程研究范圍 酶工程的研究范圍主要包括 ： （ 1） 酶的研制與生產(chǎn) （ 2）酶（細(xì)胞）的固定化技術(shù) （ 3）酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與應(yīng)用技術(shù) （ 4）酶分子結(jié)構(gòu)改造和修飾技術(shù) （ 5）酶的分子定向進(jìn)化技術(shù) （ 6）抗體酶技術(shù) 6 四 、酶工程技術(shù)的發(fā)展 早期酶工程技術(shù)主要是指從動、植物，微生物材料中提取、分離純化制造各種酶制劑，并將其應(yīng)用于化工、食品和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。 4 二、酶工程簡介 酶工程（ Enzyme engineering） 是飛速發(fā)展的現(xiàn)代生物技術(shù)中四大工程之一。 3 然而，在酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，天然酶存在著以下 缺點(diǎn) ： 穩(wěn)定性差，對熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑及重金屬離子等十分敏感； 天然酶使用后通常不易回收，不能連續(xù)使用，使用效率低，產(chǎn)品成本高，產(chǎn)品質(zhì)量受影響。1 第三章 酶工程 授課人：譚樹華 博士 聯(lián)系方式： 2 第三章 酶工程 第一節(jié) 概 述 一、酶的定義和特性 酶（ Enzyme） 是生物體內(nèi)所產(chǎn)生的具有特殊催化功能的一類蛋白質(zhì)，也稱為生物催化劑，生物體內(nèi)一切化學(xué)反應(yīng)幾乎都是在酶的催化下完成的。 與一般化學(xué)催化劑相比，酶具有以下特性：酶是蛋白質(zhì)； 酶的催化效率非常高（比一般催化劑高出 1071013倍） ； 酶具有高度的專一性； 酶的反應(yīng)條件溫和（常溫、常壓） ； 酶的催化活性受到調(diào)節(jié)和控制。 因此，盡管目前已發(fā)現(xiàn)了 3000多種酶，但真正在工業(yè)生產(chǎn)上能夠得到實(shí)際應(yīng)用的還只有 100種左右。它是指通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法和 DNA重組技術(shù)改善自然酶的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以提高酶的催化效率、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用的技術(shù)。 然而，工業(yè)上直接利用酶制劑存在一些缺點(diǎn)，如穩(wěn)定性差、使用效率低、不能在有機(jī)溶劑中反應(yīng)等。 7 1969年日本的千佃一郎等首先在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用固定化氨基酰化酶生產(chǎn) L氨基酸，至今已有多種固定化酶（細(xì)胞）獲得工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用。 1971年，第一屆國際酶工程學(xué)會議在美國新罕布夏州的亨尼克召開，會議提出的酶工程研究內(nèi)容為 ①酶制劑的研制； ② 固定化酶（細(xì)胞）及其反應(yīng)器的研究與應(yīng)用。 這主要體現(xiàn)在： 應(yīng)用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)所需要的酶制劑； 利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)或化學(xué)修飾技術(shù)對酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，從而改善其生化特性（如提高酶的穩(wěn)定性與催化活性、消除或降低酶的抗原性等），使其更適合于生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用?？梢哉f，沒有固定化技術(shù)的開發(fā)，就沒有現(xiàn)代酶工程。 它是近代酶工程技術(shù)的主要研究領(lǐng)域 。 10 與天然酶相比，固定化酶具有以下優(yōu)點(diǎn)： （ 1）穩(wěn)定性較天然酶高，如固定化氨基酰化酶用于拆分 DL氨基酸時(shí)，反應(yīng)半衰期為 65天； （ 2）反應(yīng)后，酶與底物易于分開，并可長期反復(fù)使用，因此，固定化酶又稱為 “ 常效酶 ”和 “ 長壽酶 ” ，如利用固定化黃色短桿菌的延胡索酸酶生產(chǎn) L蘋果酸，可以連續(xù)反應(yīng)一年； （ 3）反應(yīng)液中無殘留酶，產(chǎn)物易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高； 11 （ 4）可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)連續(xù)化和自動化控制； （ 5）酶的利用效率高，產(chǎn)品成本低。 固定化細(xì)胞技術(shù)是固定化酶技術(shù)的延伸 ，因此 ， 固定化細(xì)胞技術(shù)又稱為第二代固定化酶 。 13 固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)在于： （ 1） 無需進(jìn)行酶的分離純化 、 減少起始投資； （ 2） 細(xì)胞保持原初生命活動狀態(tài) ， 固定化過程酶回收率高； （ 3） 細(xì)胞內(nèi)酶較固定化酶穩(wěn)定性更高； （ 4） 細(xì)胞內(nèi)輔因子可以自動再生； （ 5） 細(xì)胞本身含多酶體系 ， 可催化一系列反應(yīng)； （ 6） 抗污染能力強(qiáng) 。 目前 ， 工業(yè)上已應(yīng)用的固定化細(xì)胞有多種 ，如固定化 LAsp、 6APA、 固定化黃色短桿菌生產(chǎn) L蘋果酸 、 固定化假單胞菌生產(chǎn)LAla等 。酶和細(xì)胞的固定化實(shí)際上是具有催化活性的的蛋白質(zhì)的固定化。當(dāng)高級結(jié)構(gòu)或活性中心發(fā)生變化時(shí)，酶的催化活性便下降，酶的的特異性也可能發(fā)生改變，因此在制備固定化酶時(shí)必須嚴(yán)格操作條件，盡可能避免酶的的高級結(jié)構(gòu)受到破壞。 17 18 固定化酶 方法 吸附法 共價(jià) 結(jié)合法 交聯(lián)法 包埋法 凝膠包埋 微囊包埋 物理吸附 離子吸附 四、固定化酶的制備方法 19 20 21 1. 吸附法 吸附法分為 ： 物理吸附法 及 離子交換劑吸附法 。 用于離子吸附法的載體有 CM纖維素、 DEAE纖維素和 DEAE－ Sephadex、 合成的大孔陽離子和陰離子交換樹脂等。 吸附法的 缺點(diǎn) ：最適吸附酶量無規(guī)律遵循，對不同載體和不同酶的吸附條件不同，吸附量與酶活力不一定呈平行關(guān)系。 23 2. 共價(jià)結(jié)合法 酶分子的活性基團(tuán)與載體表面活潑基團(tuán)之間經(jīng)化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的連接法稱為共價(jià)結(jié)合法。酶分子上含有多種化學(xué)基團(tuán)，但目前考慮進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)主要是 氨基、羧基、酚基及咪唑基 等。 24 共價(jià)結(jié)合法的 優(yōu)點(diǎn) ：酶與載體結(jié)合牢固，操作穩(wěn)定性良好。 25 因此，在進(jìn)行共價(jià)結(jié)合法操作之前需要充分了解相應(yīng)酶的氨基酸組成及其活性中心氨基酸組成，選擇適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑及抑制劑，掌握化學(xué)修飾對酶性質(zhì)的影響以及酶構(gòu)象等有關(guān)信息，以便嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，提高固定化酶活力回收率及其相對活力。 目前用于載體活化的方法有 ?；?、 芳基化 、烷基化及氨甲?；?等反應(yīng) 。 27 盡管共價(jià)結(jié)合法制備固定化酶研究較多，但因固定化操作繁瑣，酶損失大，起始投資大，因之，醫(yī)藥及食品工業(yè)中應(yīng)用者甚少。 本法又分為 （ 1）交聯(lián)酶法、（ 2）酶與輔助蛋白交聯(lián)法、（ 3）吸附交聯(lián)法、（ 4）載體交聯(lián)法 。以戊二醛為交聯(lián)劑的酶結(jié)合模式是將戊二醛與酶分子之間通過 Shiff’s堿方式相連接。 酶晶體