【文章內(nèi)容簡介】 界溫度和壓力達到選擇性提取和分離純化的目的。缺點是超臨界提取所需設(shè)備價格昂貴、生產(chǎn)成本高、提取物中烷基酚含量較高、對極性大的物質(zhì)提取不理想。目前還難以進行規(guī)模化生產(chǎn)，但本法在生產(chǎn)銀杏黃酮的技術(shù)上取得了重大突破. 黃酮類化合物的常用分析側(cè)定方法(1) 比色法這是分析提取物總黃酮含量最普遍的方法。通常采用的顯色方法有以下兩種[[]蔣捷. 柚皮黃酮提取研究. 碩士學位論文. 湖南農(nóng)業(yè)大學]：亞硝酸鈉硝酸鋁顯色法 以蘆丁為標樣，將一定量提取液置25mL比色管中，用30％(v/v)，％NaNO2，搖勻，％Al(NO3)3，6min后再加入5mL4％NaOH，搖勻，用30％(v/v)L醇稀釋至刻度，10rain后于510nm進行比色。AlCl3顯色法 以蘆丁為標樣，在測定液中加入AlCl3搖勻，室溫放置10min，按分光光度法，在200500nm范圍內(nèi)迸行掃描，尋找二者重疊最吸收波長，測定。兩種方法機理不同，亞硝酸鈉硝酸鋁顯色原理文獻認為是蘆丁NaNO2Al(NO3)3NaOH試劑在蘆丁B環(huán)的3’,4鄰二酚羥基部位反應產(chǎn)生紅色物質(zhì)。AlCl3顯色法原理是Al3+與3或5fE基與4羥基，或者B環(huán)的3’,4二鄰二酚羥基絡合顯色。(2) 紫外法采用標準品與提取液在紫外區(qū)掃描，確定最大吸收波長，制標準曲線測定總黃酮含量(3) HPLC法在銀杏、花生殼的黃酮定量中，由于黃酮苷較多，多采用酸水解成苷元，在測定總黃酮的方法中，大多采用榭皮素作對照品，也有用懈皮素、山奈酚和異鼠李素三種作為對照品。 研究的目的與內(nèi)容本文的研究目的是應用有機溶劑萃取方法，提取決明子中黃酮類化合物。重點研究不同提取條件對黃酮提取效率的影響，確定其影響程度的大小，尋找最佳提取工藝條件。本論文的研究包括以下內(nèi)容：(1) 蘆丁標準曲線的繪制。(2) 決明子中黃酮總含量的測定。(3) 不同提取劑對決明子中黃酮浸提效果的影響。(4) 乙醇濃度對決明子中黃酮浸提效果的影響。(5) 提取溫度對決明子中黃酮浸提效果的影響。(6) 提取時間對決明子中黃酮浸提效果的影響。(7) 料液比對決明子中黃酮浸提效果的影響。(8) 進行正交實驗確定最佳提取條件。 31 第2章 實驗部分黃酮類化合物的溶解度與黃酮苷元的結(jié)構(gòu)及其配基的不同而有很大的差異，一般游離苷元難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑中。黃酮類苷元分子中引入的羥基越多，其溶解度越大。黃酮類化合物的羥基糖苷元化后，水溶解度較大，而在一些較低極性的有機溶劑中溶解度較低。黃酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等強極性的溶劑中；難溶于或不溶于苯、氯仿等有機溶劑中。糖鏈越長，則水溶解度越大。 儀器與藥品 實驗儀器表21 實驗儀器名稱型號生產(chǎn)廠家循環(huán)水式多用真空泵SHB—Ⅲ鄭州長城科工貿(mào)有限公司電子恒溫不銹鋼水浴鍋HHS—2S上海市南陽儀器有限公司可見分光光度計722N上海精科電子有限公司調(diào)溫電加熱套DZHW河北省黃驊市中興儀器有限公司電子天平AW220慈溪市天東衡器廠大功率粉碎機QE—100武漢縣工具有限公司索氏提取器天津北辰區(qū)光明儀器廠蒸餾裝置M22型中量天津玻璃儀器廠電熱干燥箱202—3北京金北德工貿(mào)有限公司 實驗藥品選用決明子在北吉大藥房購得，產(chǎn)地為廣西省。表22 實驗藥品名稱分子式純度生產(chǎn)廠家蘆丁標準物質(zhì)C27H30O16西安旭煌生物技術(shù)有限公司95%乙醇CH3CH2OH天津永晟精細化工有限公司無水甲醇CH3OH天津光復精細化工研究所丙酮CH3COCH天津風船化學試劑科技有限公司石油醚天津永晟精細化工有限公司亞硝酸鈉NaNO2天津永晟精細化工有限公司硝酸鋁Al2(NO3)39H2O天津永晟精細化工有限公司氫氧化鈉NaOH天津永晟精細化工有限公司。 實驗過程 實驗流程及裝置圖實驗流程如圖21所示。圖21 黃酮提取實驗流程實驗所用儀器裝置見圖22.、23圖22 提取裝置圖23 蒸餾裝置 實驗方案1. 標準溶液的配制和標準曲線制作將蘆丁于120℃下干燥至恒重，用30％乙醇溶解，定溶于100mL。準確吸取蘆丁標準液0mL、、加入5%，搖勻，放置6min后加入10%Al(N03)，搖勻，放置6min后加入4%，再用30%乙醇定容，搖勻，以30%乙醇為空白參比，l0min后用lcm比色皿于510nm測定吸光度A，得到蘆丁標樣含量Y(μg/mL)與吸光度A間的關(guān)系，畫出標準曲線[[]陳林. 比色法測定枸杞袋泡茶中總黃酮含量[J]. 山東醫(yī)藥工業(yè), 2003,(22)2:2021.]。2. 決明子中黃酮平均含量的提取及測定決明子中總黃酮平均含量的測定。，用濾紙包住并用棉線捆好，置于索氏提取器中，用100mL甲醇體積濃度75％，80℃水浴加熱回流，當索氏提取器中的溶液由黃色接近無色時，取出用濾紙包住的決明子粉末，蒸餾回收甲醇至近干，加水約80mL溶解，加入20mL石油醚脫色2次，棄去醚層。加水于100mL容量瓶中定容，作為待測液[17]。取待測液10mL于50mL容量瓶中，用30％乙醇定容，以下按照測定蘆丁標準液吸光度的方法測定吸光度A。重復3次，結(jié)果取平均值[[]張?zhí)m杰, 張維華, 鄭紅軍. 千山?jīng)Q明子總黃酮含量的測定[J]. 食品科學, 2003, 24(12): 101104.]。從決明子中提取的黃酮含量可按下列公式計算：M(%)=[Y(100/10)(50/2)10106100]/w式中：100/10 和50/2—稀釋倍數(shù)；w—決明子重(g)。提取率(%)=(提取黃酮含量/決明子中總黃酮的平均含量)100[18]。3. 決明子中總黃酮的提取及測定，按照設(shè)計的配方加入一定量的提取劑，在一定溫度下回流提取一定時間，趁熱減壓抽濾，濾渣加適量水洗滌、過濾．合并清液后得提取液，再蒸餾，回收溶劑至近干，再按照2中的步驟配置待測液，以下按照測定蘆丁標準液吸光度的方法測定吸光度A，計算黃酮提取率[[]王小華, 鄧斌, 張曉軍, 王存嫦. 決明子黃酮類化合物的提取工藝研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2008, 24: 711.[20]Hongbin Zhu, Yuzhi Wang, Yuxuan Liu, Yalin Xia, Tian Tang. Analysis of Flavonoids in Portulaca oleracea L. by UV–Vis Spectrophotometry with Comparative Study on Different Extraction Technologies. Food Anal. Methods, 200,3:90–97]。4. 提取溶劑的選擇分別用沸水、堿性水溶液()、75％乙醇溶液、75％甲醇溶液、75％丙酮溶液[16]，80℃水浴下，料液比為1:20分別提取，測定其吸光度，計算其提取率分別。5. 影響提取效果的因素(1) 乙醇濃度對浸提效果的影響分別采用65%、75%、80%、85%、95%的乙醇濃度按3的操作步驟進行試驗，在80℃下，料液比為1:20，提取決明子中黃酮類化合物的試驗，得出乙醇濃度對提取效果的影響。(2) 提取溫度對浸提效果的影響分別采用50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、的提取溫度[16]按3的操作步驟進行試驗，以濃度為75%的乙醇為提取劑，料液比為1:20，提取決明子中黃酮類化合物的試驗，得出提取溫度對提取效果的影響。(3) 料液比對浸提效果的影響分別采用1:1:1:21:1:35(g:mL)的料液比例按3的操作步驟進行試驗，以濃度為75%的乙醇為提取劑，提取溫度為80℃時，提取決明子中黃酮類化合物的試驗，得出料液比對提取效果的影響。(4) 提取時間對浸提效果的影響、以濃度為75%的乙醇為提取劑，提取溫度為80℃，料液比為1:20，提取決明子中黃酮類化合物的試驗，得出提取時間對提取效果的影響。單因素實驗條件見表23所示。表23單因素實驗條件表乙醇濃度提取溫度料液比提取時間恒溫水浴80℃75%濃度乙醇75%濃度乙醇75%濃度乙醇恒溫水浴80℃料液比1:20g:ml料液比1:20g:ml恒溫水浴80℃料液比1:20g:ml165%60℃1:10275%70℃1:20380%80℃1:25485%90℃1:30595%60℃1:356. 正交試驗確定提取的最佳條件為了全面考查影響因素，設(shè)計了4因素3水平的正交試驗，試驗因素水平見表24，L9(34)正交表見表25。表24 正交實驗因素水平表水平因素乙醇體積分數(shù)(A) %溫度(B) ℃料液比(C) g:mL浸提時間(D h165701:20275801:25385901:30表25 L9(34)正交表ABCD111112122231333421235223162312731328321393321 實驗過程中主要事項(1) 決明子粉碎粒度要均勻，使用前要經(jīng)過一定的干燥處理。(2) 提取過程中，保持提取溫度穩(wěn)定，一定不能使溶劑揮發(fā)。(3) 蒸餾回收乙醇過程中，溫度上升到90℃左右是，停止加熱，防止過熱使黃酮分解。(4) 脫色除脂過程中，要待分層結(jié)束，醚層上部出現(xiàn)澄清液時，再分液。(5) 配置黃酮標準液時，加入顯色劑后，需靜止一段時間，再加下一種藥品。第3章 結(jié)果與討論 蘆丁標準曲線的制作本實驗過程中，黃酮類化合物檢測以標準物質(zhì)，應用亞硝酸鈉硝酸鋁顯色法，通過測定吸光度來確定黃酮類物質(zhì)的含量?？梢姺止夤舛扔嫷牟ㄩL選取510nm。其結(jié)果見表31表31 標準工作曲線的測定結(jié)果V蘆丁溶液（mL）C蘆丁標準溶液（μg/mL）吸光度A100213243546576由上表，以吸光度值——蘆丁濃度作圖得， 圖31蘆丁標準工作曲線圖用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁濃度C與吸光度A的標準曲線回歸方程式：C=，相關(guān)系數(shù)R2= 黃酮含量及提取率黃酮總含量的測定應用索氏提取器，測定3次，求的平均含量。(++)/3=，由圖31的。M(%)=[Y(100/10)(50/2)10106100]/w。M(%)=[102510106100]/3=%。 單因素實驗結(jié)果 提取劑的影響通常按極性化合物易溶于極性溶劑，非極性化合物易溶于非極性溶劑，同類分子或官能團相似的彼此互溶的一般規(guī)律來選擇，溶劑選擇適當，就可以比較順利地將需要的成分提取出來。選取溶劑的要求是:(1) 溶劑對所需成分的溶解度要大，對雜質(zhì)的溶解度要小，或反之。(2) 溶耕不能與植物成分產(chǎn)生化學反應，即使反應亦屬于可逆性的。(3) 溶劑要經(jīng)濟易得，并具有一定的安全性．(4) 沸點應適中，便于回收反復使用。本實驗中選取沸水、PH=9的堿性水溶液、75％乙醇溶液、75％甲醇溶液、75％丙酮溶液實驗結(jié)果如圖32。圖32 提取劑的影響提取劑種類吸光度A提取率(%)黃酮濃度(μg/mL)沸水堿性水溶液（PH=9）1375%乙醇75%甲醇75%丙酮提取溶劑種類對黃酮的提取率的影響效果見圖32圖32 提取劑種類的影響從圖21以看出，在提取時間，提取料液比和一定的情況下，以水為提取劑的提取效果最差。堿性水溶液的提取效果略好，但是提取液顏色偏灰色，雜質(zhì)較經(jīng)石油醚脫色，提取效率與沸水相比提取并不多。以甲醇、乙醇和丙酮作為提取劑時效果較好，三種提取劑提取效率相差不大，