【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 II型 微生物發(fā)酵形成產(chǎn)物的過(guò)程與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程并不總是一致的。一般認(rèn)為： 初級(jí)代謝 是給予生物能量和生成中間產(chǎn)物的過(guò)程， 初級(jí)代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細(xì)胞的形成過(guò)程同步，微生物生長(zhǎng)的穩(wěn)定期是這些產(chǎn)物的最佳收獲時(shí)機(jī)； 次級(jí)代謝產(chǎn)物 與微生物的生存、生長(zhǎng)和繁殖無(wú)關(guān)。次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細(xì)胞的形成過(guò)程不同步。在分批培養(yǎng)中，它們的形成高峰往往在微生物生長(zhǎng)穩(wěn)定期的后期或衰亡期。 51 絲狀微生物的純培養(yǎng)采用孢子接種，在液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)或深層通氣加攪拌培養(yǎng)，菌絲體通過(guò)斷裂繁殖不形成產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)?？梢杂镁z干重作為衡量生長(zhǎng)的指標(biāo)，即以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌絲干重為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。 可分為三個(gè)階段： 生長(zhǎng)停滯期 迅速生長(zhǎng)期 衰退期 52 生長(zhǎng)停滯期 : 造成生長(zhǎng)停滯的原因一是孢子萌發(fā)前真正的停滯狀態(tài)，另一種是生長(zhǎng)已經(jīng)開始，但還無(wú)法測(cè)定。 迅速生長(zhǎng)期 :菌絲體干重迅速增加，其立方根與時(shí)間呈直線關(guān)系，菌絲干重不以幾何級(jí)數(shù)增加，沒有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。生長(zhǎng)主要表現(xiàn)在菌絲尖端的伸長(zhǎng)和出現(xiàn)分支、斷裂等，此時(shí)期的菌體呼吸強(qiáng)度達(dá)到高峰，有的開始積累代謝產(chǎn)物。 衰退期 :菌絲體干重下降，到一定時(shí)期不再變化。大多數(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)物在此期合成，大多數(shù)細(xì)胞都出現(xiàn)大的空泡。有些菌絲體還會(huì)發(fā)生自溶菌絲體，這與菌種和培養(yǎng)條件有關(guān)。 53 三 微生物的連續(xù)培養(yǎng) （ continuous culture） 分批培養(yǎng) （ batch culture） ：將微生物臵于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補(bǔ)充和更換，最后一次性收獲。 連續(xù)培養(yǎng) （ continuous culture） ：在微生物培養(yǎng)的過(guò)程中，不斷地供給新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長(zhǎng)時(shí)間地處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。 連續(xù)培養(yǎng) 理論基礎(chǔ) ：由于對(duì)典型生長(zhǎng)曲線中穩(wěn)定期到來(lái)原因的認(rèn)識(shí)，采取相應(yīng)有效措施推遲其來(lái)臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。 54 原理：當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能長(zhǎng)期保持對(duì)數(shù)期的平衡生長(zhǎng)狀態(tài)和穩(wěn)定的生長(zhǎng)速率。 單批培養(yǎng) 恒濁法 恒化法 單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時(shí)間 連續(xù)流入 新鮮培養(yǎng)液 lg細(xì)胞數(shù)（個(gè)/ml） 連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)原理 55 連續(xù) 培養(yǎng)器 按控制方式分 按培養(yǎng)器的級(jí)數(shù)分 按細(xì)胞狀態(tài)分 按用途分 內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器 外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長(zhǎng)速率）：恒化器 單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器 多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器 一般連續(xù)培養(yǎng)器 固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)器 實(shí)驗(yàn)室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器 發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐 連續(xù)培養(yǎng)器 56 連續(xù)培養(yǎng)技術(shù) —— 恒化連續(xù)培養(yǎng) 概念 ：以恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長(zhǎng)速率恒定的方法。 原理： 通過(guò)控制某一種營(yíng)養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長(zhǎng)因子等） ，使其始終成為生長(zhǎng)限制因子，而達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。 特點(diǎn)： 維持營(yíng)養(yǎng)成分的 亞適量 ，控制微生物生長(zhǎng)速率。菌體生長(zhǎng)速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。 應(yīng)用范圍： 實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究 57 Figure . Schematic diagram of a chemostat, a device for the continuous culture of bacteria. The chemostat relieves the environmental conditions that restrict growth by continuously supplying nutrients to cells and removing waste substances and spent cells from the culture medium. 58 恒化器 Chemostat 或 bactogen 59 概念： 通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。 原理 ：通過(guò)調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來(lái) 維持菌濃度不變 ,即濁度不變 。主要采用恒濁器，當(dāng)濁度高時(shí)，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。 特點(diǎn)： 基質(zhì)過(guò)量，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長(zhǎng)，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復(fù)雜，煩瑣。 連續(xù)培養(yǎng)技術(shù) —— 恒濁培養(yǎng) 使用范圍： 用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長(zhǎng)相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。 60 裝臵 控制對(duì)象 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基流速 生長(zhǎng)速率 產(chǎn)物 應(yīng)用范圍 恒濁器 菌體密度（內(nèi)控制） 無(wú)限制生長(zhǎng)因子 不恒定 最高 大量菌體或與菌體形成相平行的產(chǎn)物 生產(chǎn)為主 恒化器 培養(yǎng)基流速（外控制） 有限制生長(zhǎng)因子 恒定 低于最高 不同生長(zhǎng)速率的菌體 實(shí)驗(yàn)室為主 恒濁器與恒化器的比較 61 連續(xù)發(fā)酵（ continuous fermentation） 連續(xù)培養(yǎng)在生產(chǎn)上的應(yīng)用，相對(duì)于單批發(fā)酵而言。 優(yōu)點(diǎn)： –高效，簡(jiǎn)化了操作 —— 裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等單元操作； –自控：便于利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制； –產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 –節(jié)約大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、電的負(fù)荷均衡合理。 缺點(diǎn)：菌種易于退化；易于遭到雜菌污染；營(yíng)養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。 連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)時(shí)間受以上因素限制，一般只能維持?jǐn)?shù)月 ~ 1年。 62 微生物與所處的環(huán)境之間具有復(fù)雜的相互影響和相互作用 :一方面 ,各種各樣的環(huán)境因素對(duì)微生物的生長(zhǎng)和繁殖有影響 ,另一方面 ,微生物生長(zhǎng)繁殖也會(huì)影響和改變環(huán)境 .研究環(huán)境因素與微生物之間的關(guān)系 ,可以通過(guò)控制環(huán)境條件來(lái)利用微生物有益的一面 ,同時(shí)防止它有害的一面 . 第三節(jié) 環(huán)境因素對(duì)微生物的影響 ?影響微生物生長(zhǎng)的外界因素很多，除了前面講過(guò)的營(yíng)養(yǎng)因素之外，還有許多物理化學(xué)條件。 ?本節(jié)主要內(nèi)容： ?一、溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 ?二、氧氣對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 ?三、 pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 63 幾個(gè)基本概念 ?滅菌（ sterilization） 采用強(qiáng)烈的禮花因素是任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施，稱為滅菌。 ?消毒（ disinfection） 采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對(duì)人體有害的病原菌，而對(duì)被處理物體基本無(wú)害的措施，稱為消毒。 ?防腐（ antisepsis） 利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到防止物品發(fā)生霉腐的措施，稱為防腐。 ?化療（ chemotheraphy） 即化學(xué)治療。利用具有高度選擇毒力的化學(xué)物質(zhì)抑制宿主體內(nèi)病院微生物的生長(zhǎng)繁殖，以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。 65 溫度是影響微生物生長(zhǎng)的最重要因素之一。 溫度對(duì)微生物的影響具體表現(xiàn)在： ?影響酶活性，溫度變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響細(xì)胞合成。 ?影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，溫度高，流動(dòng)性大，有利于物質(zhì)的運(yùn)輸，溫度低，流動(dòng)性降低，不利于物質(zhì)運(yùn)輸，因此，溫度變化影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。 ?影響物質(zhì)的溶解度，對(duì)生長(zhǎng)有影響。 一、溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 66 從微生物整體來(lái)看 : 生長(zhǎng)的溫度范圍一般在 10 ℃ ~100 ℃ 極端下限為 30 ℃ ，極端上限為 105~300 ℃ 但對(duì)于特定的某一種微生物： 只能在一定溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，在這個(gè)范圍內(nèi)，每種微生物都有自己的 生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn) ，即 最低、最適、最高生長(zhǎng)溫度 ?處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，生長(zhǎng)速度最快，代時(shí)最短。 ?超過(guò)最低生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物不生長(zhǎng)，溫度過(guò)低，甚至?xí)劳觥? ?超過(guò)最高生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物不生長(zhǎng)，溫度過(guò)高，甚至?xí)劳觥? （一）微生物生長(zhǎng)的三個(gè)溫度基點(diǎn) 67 根據(jù)微生物的最適生長(zhǎng)溫度的不同，可將微生物劃為 三個(gè)類型 ： （二）微生物生長(zhǎng)溫度類型 ?低溫型微生物（嗜冷微生物） ?中溫型微生物（嗜溫微生物） ?高溫型微生物（嗜熱微生物） 68 69 低溫型微生物 : ?最適生長(zhǎng)溫度在 5~20℃ ,主要分布在地球的兩極、冷泉、深海、冷凍場(chǎng)所及冷藏食品中。 例：假單孢菌中的某些嗜冷菌在低溫下生長(zhǎng)，常引起冷藏食品的腐敗。 ?嗜冷微生物在低溫下生長(zhǎng)的機(jī)理， 目前還不清楚，據(jù)推測(cè)有兩種原因： ①它們體內(nèi)的酶能在低溫下有效地催化，在高溫下酶活喪失②細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸含量高，低溫下也能保持半流動(dòng)狀態(tài)，可以進(jìn)行物質(zhì)的傳遞。 70 中溫型微生物： ?最適生長(zhǎng)溫度為 20℃ ~40 ℃ ，大多數(shù)微生物屬于此類。 ?室溫型主要為腐生或植物寄生，在植物或土壤中。 ?體溫型主要為寄生，在人和動(dòng)物體內(nèi)。 高溫型微生物： ?最適生長(zhǎng)溫度為 50 ℃ ~60 ℃ ,主要分布在溫泉、堆肥和土壤中。 ?在高溫下能生長(zhǎng)的原因： ①酶蛋以及核糖體有較強(qiáng)的抗熱性②核酸具有較高的熱穩(wěn)定性（ 核酸中 G+C含量高（ tRNA），可提供形成 氫鍵，增加熱穩(wěn)定性 ）。 ③細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量高，較高溫度下能維持正常的液晶狀態(tài)。 71 高溫微生物的特點(diǎn) : ?生長(zhǎng)速度快，合成大分子迅速，可及時(shí)修復(fù)高溫對(duì)其造成的分子損傷。 ?耐高溫菌具應(yīng)用優(yōu)勢(shì) ：在減少能源消耗、減少染菌、縮短發(fā)酵周期等方面具重要意義。 72 菌 名 生長(zhǎng)溫度 發(fā)酵溫度 累積產(chǎn)物溫度 （ ℃ ） （ ℃ ） （ ℃ ） Streptococcus thermophilus 37 47 37 34 40 產(chǎn)細(xì)胞： 25~30 產(chǎn)乳酸： 30 Streptomyces griseus 37 28 _ Corenybacterium pekinense 32 33~35 _ Clostridium acetobutylicum 37 33 _ Penicilium chrysogenum 30 25 20 以青霉素的生產(chǎn)為例：培養(yǎng) 165小時(shí)采用 分段控制溫度 的方法，其青霉素產(chǎn)量比始終在 30 ℃ 培養(yǎng)提高了 %。 分段控制方式： 0~5小時(shí)， 30 ℃ ； 5~40小時(shí)， 25 ℃ ；40~125小時(shí)， 20 ℃ ； 125~165小時(shí)， 25 ℃ 。 ★ 不同生理生化過(guò)程的最適溫度 ?微生物不同生理活動(dòng)要求不同溫度，所以， ? 最適生長(zhǎng)溫度 ≠ 發(fā)酵速度快、積累代謝產(chǎn)物多。 73 高溫對(duì)微生物的影響 高溫下蛋白質(zhì)不可逆變性，膜受熱出現(xiàn)小孔，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（溶菌）。 ★微生物對(duì)熱的耐受力與以下因素有關(guān) : (1)微生物種類及發(fā)育階段 ?嗜熱菌比其它類型的菌體抗熱 ?有芽孢的細(xì)菌比無(wú)芽孢的菌抗熱 ?微生物的繁殖結(jié)構(gòu)比營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)抗熱性強(qiáng) ?老齡菌比幼齡菌抗熱 （三）高溫與低溫對(duì)微生物的影響 74 (2)微生物對(duì)熱的耐受力還受 環(huán)境條件 的影響 ?與培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān) —— 培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量高時(shí)比較耐熱 . ?與 pH 有關(guān) —— pH適宜時(shí)不易死亡， pH不適宜時(shí)，容易死亡 . ?與水分有關(guān) —— 含水量大時(shí)容易死亡，含水量小時(shí)不容易死亡 . ?與含菌量有關(guān) —— 含菌量高，抗熱性增強(qiáng)，含菌量低，抗熱性差。 ?與熱處理時(shí)間有關(guān) —— 熱處理時(shí)間長(zhǎng)，微生物易死亡。 75 當(dāng)環(huán)境溫度低于微生物的最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物的生長(zhǎng)繁殖停止，當(dāng)微生物的原生質(zhì)結(jié)構(gòu)并未破壞時(shí)，不會(huì)很快造成死亡并能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持活力，當(dāng)溫度提高時(shí)，可以恢復(fù)正常的生命活動(dòng)。 低溫保藏菌種就是利用這個(gè)原理。一些細(xì)菌、酵母菌和霉菌的瓊脂斜面菌種通?？梢蚤L(zhǎng)時(shí)間地保藏在 4℃ 的冰箱中。 當(dāng)溫度過(guò)低，造成微生物細(xì)胞凍結(jié)時(shí)，有的微生物會(huì)死亡，有些則并不死亡。 低溫對(duì)微生物的影響 76 造成死亡的原因： ①凍結(jié)時(shí)細(xì)胞水分變成冰晶，冰晶對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生機(jī)械損傷