【文章內(nèi)容簡介】 配有電霧化學源，質(zhì)譜工作站。 實方法驗 花生樣品的處理 花生種植后，樣品被粉碎，利用索氏提取脫脂，脫脂干燥后是一種粗蛋白粉，稱 0 . g 蛋白粉末。 花生中 PC 的提取 根據(jù) sneller（ 2022）的方法，把花生鮮樣用液氮在研缽中磨碎，然后冷凍干燥達70 小時，冷凍干燥以后稱量約 的花生，再加入 7mL 的 % TFA（含， PH1)，充分振蕩 30min ，然后 4 度下， 在約 10000 r/m in 離心率下離心 20 m i n ， 吸取上清液以備待測用。 巰基化合物標準品的配制 選用 % TFA(含 /L 的 LDTPA) 制成 4 種巰基化合物貯備液，濃度均為 1mmol /L 的，分別為： Cd PC 標準品（ (美國 Waters 公司）， Cys 和 GSH 備用液，置于 4℃冰箱保存 。 花生中 GSH， PC 等總含量的測定 配置含 mmol /L 的埃爾 曼試劑試劑顯色劑 (含 mmol /L 的 DTPA)的 200 mmol /L 的 HEPPS 緩沖液（ pH = ），避光保存 ， 取花生組織提取液 300 L 加到 300L DTNB 顯色劑中，混勻后在 30℃下反應 3 min，其中 GSH， PC 和 TNB 會發(fā)生反應，生成黃色化合物，非蛋白巰基化合物與黃色化合物含量符合 1:1 的 比例關系， 依據(jù)有差別的花生樣品在 420 nm 下的吸光度值不同，便可計算出花生樣品中巰基含量。 衍生試劑 (mBBr)的配制及柱前衍生反應 6 衍生試劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用，用 100%的 乙腈正確配制 250mmol /L的 mBBr衍生試劑，搖勻后，置于 4℃冰箱避光保存。柱前衍生化反應為將 10 L 25mmol/ L 的 mBBr 和 670 L 200 mmol/LHEPPS(pH = )加到 300L 的 4 種標準液和植物組織上清液中，充分混合 ， 37℃孵化反應 40min，于 200 L 的 1 mmol/L MSA 激波旋渦抖動，停止反應，并作試劑空白的衍生反應，反應液在 4℃冰箱避光保存，等待高效液相色譜法測定。 色譜質(zhì)譜條件 （ 1） 實驗的色譜條件 ： 選用洗脫劑為 0 .1 % 三 氟乙酸 ( TFA)乙腈進行梯度淋洗， 流速為 /min； 淋洗梯度條件見表 ； 設置柱溫為 30℃ ； 220280 nm 的 二極管陣列檢測 ； 進樣容量為 10ml。 表 淋洗梯度 時間（ M） 三氟乙酸 (0. 1%) 乙腈 (色譜純 ) 流速（ ） 0 100 20 10 100 20 40 20 100 60 100 20 （ 2）質(zhì)譜條件 ： 柱子型號為 SB C18； 電噴霧電離的方式，噴霧電壓 ： kV； 掃描范圍是 ： m / z 6001500； 錐電壓為 ： 25 V； 采樣錐電壓： 20 V； 溶劑氣體溫度為： 360℃ ；采樣錐電壓： 20 V； 氣體溫度和溶劑： 360℃ ； 脫溶劑氣流量 ： 110m L /h。 7 第 2 章 實驗結果和討論 PCs 標準樣品混合物的色譜分離 經(jīng)提取的 GSH， PCs 巰基化合物和衍生試劑 (mBBr) 在 45℃的條件下衍生反應40min 以后，生成帶有熒光的衍物 mBSR， 在 MBSR 流線（ ACN % TFA）下，一定濃度的混合樣品的 4 種化合物和 GSH 的 分離是很清楚的，依次是 GSH ＞ PC2 ＞ PC3 ＞ PC4 這樣的分離順序 。 見圖 0 10 20 30 40 t/min 圖 混合樣品中標準 PC， GSH化合物的色譜分離 鎘對花生體內(nèi) PC 和 GSH 含量和 PCs 狀態(tài)的影響 由圖 可得到，在濃度為 60 mol/L 的 Cd 的脅迫作用下，花生體內(nèi) GSH 與未加毒的比較相比含量無有明顯差別，這是由于土壤環(huán)境中有 Fe 或者 Zn 等金屬 離子的 存在使得在無 Cd 的對照組中也檢測到 了 PC2 ，通過設置多重比較，可知，花生經(jīng) Cd 處理后誘導花生產(chǎn)生了 PC4，在 Cd 的影響下花生體內(nèi)產(chǎn)生的含量最大的是PC3， PC4 與 PC2 含量沒有明顯的差異。 8 圖 花生樣品中 GSH， PCs的分離色譜圖 圖 Cd脅迫下花生中 GSH， PCs的 含量 花生樣品中 PC4 的含量檢測 選擇 HPLC 質(zhì)譜條件 選用正離子模式，負離子形式分別掃描濃度為 /L 的 PC 標準溶液，證實PC4 在負離子模式下信號反應很弱，在正離子模式下反應信號比較靈敏。優(yōu)化正離子 9 掃描條件下各種條件，例如錐電壓為 ： 25 V； 噴霧電壓為 ： kV； 溶劑氣體溫度的去除： 350℃ ； 采樣錐電壓 ： 20 V； 透鏡電壓 V； 錐孔溫度為 ： 105℃ ； 脫溶劑氣流量為 ： 110m L/h ； 全掃描范圍 m /z 為 ： 5001200，反吹氣流量為 ： 80m L /h。圖 為條件優(yōu)化以后 PC4 的總離子流圖，圖 為 PC4 化合物在正離子模式下的掃描質(zhì)譜圖。 圖 PC 的總離子流圖 圖 正 離子質(zhì)譜圖 10 PC4 分子式為 (γG l uCys) 4βA la ，分子量為 。從圖 6b 可以得出 ， 信號反應最強的是 m/z1018 的 [M ]+母離子峰 ； m /z 698 的是 [MGluCysAla]+離子峰， m/z 929 的為 [MAla]+離子峰，均為斷裂峰 ； m/z1019 為 [M + H ]+離子峰， m /z 521 為[M+H+ Na]2 +離子峰 ， m /z 1056 為 [M H + K ]+離子峰 ， 大概是由于環(huán)境，樣品和容器含鉀， N 和其他堿金屬，由于去除堿金屬樣品存在困難，所以 在質(zhì)譜， K 離子 往往 往 作為一個特征離子。 線性范圍和檢出限 將 PC 標準溶液稀釋成濃度為 、 、 5 .0、 和 /L 的梯度溶液，用色譜 質(zhì)譜方式測定，橫坐標用標準溶液濃度表示，縱坐標用峰面積表示，繪制這個條件下標準線性回歸曲線。當濃度為 － ，線性方程為 y = + 80275（ r=） 當信噪比 S/N=3 時，儀器檢出限為 /L，定量限為 /L。 回收率和精密度 選用統(tǒng)一花生樣品進行重 復的精密度實驗，同時設置試劑作為空白，結果見表 ， 結果表明， 本方法對濃度 水平為 /kg 的樣品中 ，測定的 PC4 平均回收率達 % ； 相對標準偏差達 %。表格 反映了回收率與精密度分析的結果 。 表格 實驗的回收率與精密度的分析結果 ( n = 3) NUMBER 分析結果 mg/kg 回收率 (%) RSD 1 2 3 實際花生樣品的分析 選用 HPLCMS 檢測方法，在兩種不同鎘水平下測定了兩個花生品種。實驗結果表明，花生樣品均有不同濃度的 PC4 化合物的發(fā)現(xiàn)，表 是測定結果， PC4 花生樣品譜圖如圖 所示。文獻表明，含（ γ谷氨酸 半胱氨酸）植物螯合肽的 Nβ丙氨酸肽鏈結構，有豆類，但沒有報告花生中包含植物螯合肽。本實驗建立了獨特的檢測方 11 法被證明花生含有丙氨酸 類 PC 化合物。 表 花生樣品中植物螯合肽測定結果 第 1組 PC4含量 (mg/kg) 第 2組 PC4含量 （ mg/kg） 圖 花生樣品中 PC4的質(zhì)譜圖 12 第 3章 結論 實驗結論 植物螯合肽在花生里存在 ，而且主要以 PC4 的形式存在；植物螯合肽可以螯合多種重金屬離子，在花生中，對金屬鎘的螯合能力最強； 關與測定方 法，目前 有： 液相色譜法，分光光度比色法，凝膠過濾法，毛細管電泳法比較被認可，而液相色譜法測定方法應用最廣，選用 mBBr 柱前衍生與高效液相色譜測定 PC 則更簡單，重現(xiàn)性更好，靈敏度更高 ， 也具有較好的分離能力 。 研究展望 本研究性實驗在先前的基礎上進行了進一步的研究，還有好多工作需進一步研究。前期實驗已經(jīng)證明豆科植物及花生中植物螯合肽的存在， 而且 螯合肽的種類主要以 PC4 的形式存在， 螯合肽 PC 的生成受哪些基因調(diào)控，或者細胞所處周期時間不同會不會影響 PC 的種類，有待我們進一步驗證。 13 參考文獻 [1]張紅 ,王艷紅 ,王 珊珊 .高效液相色譜 質(zhì)譜法測定花生中的螯合肽 [J].分析化學簡報 ,2022,37(6):881883. [2] 張靜 ,常青曉 ,孫傳范 ,段桂蘭 .HPLC 法測定鎘和砷脅