【文章內(nèi)容簡介】 p DNA marker； A1：中間片段擴增結果； B B2： 3′ RACE擴增結果； B B4： 5′ RACE擴增結果； C1：全長擴增結果。 Fig. 1 Electrophoresis results of PCR amplification of Csδ OAT M： 2 000 bp DNA marker； A1： Product of segment； B1， B2： Product of 3′ RACE； B3， B4： Product of 5′ RACE； C1： Product of full cDNA. Csδ OAT 編碼蛋白的生物信息學分析 Csδ OAT的結構域預測 利用 NCBI對 Csδ OAT的結構域和結合位點分析（圖 2）表明， Csδ OAT屬于乙酰鳥氨酸氨基 轉移酶家族，該家族是依賴磷酸吡哆醛（ PLP）的 天冬氨酸氨基轉移酶超家族。催化轉氨作用的關 鍵部位 PLP結合位點由 8個氨基酸殘基（ G138A139F173H174E228D261Q264K290）構成，其中 290位的賴 氨酸（ K）是催化中心， PLP的結合引起蛋白構象變化而激活轉氨酶活性。抑制因子結合位點由 11 個氨基酸殘基（ T137G138A139F173H174R176E228D261I263Q264K290）構成。 圖 2 Csδ OAT編碼氨基酸的保守區(qū)域分析結構圖 Fig. 2 Conserved domains analysis of Csδ OAT deduced amino acid Csδ OAT的跨膜結構預測 通過 TMPRED對 Csδ OAT 編碼的氨基酸序列進行跨膜區(qū)預測顯示，在 164 ~ 185和 285 ~ 305 形成兩個可能的跨膜螺旋，加權總分達 1 119分，遠遠大于 500（模型認為大于 500分即存在有意義 的跨膜螺旋），表明跨膜預測真實有效，因此推測該基因編碼的酶為跨膜蛋白。 12期 王偉東等：茶樹鳥氨酸轉氨酶基因 Csδ OAT 的克隆與表達分析 2469 Csδ OAT的磷酸化位點預測 用 NetPhos Serve預測 Csδ OAT蛋白的磷酸化位點（圖 3），結果表明含有絲氨酸、蘇氨酸和 酪氨酸共 21個磷酸化位點，其中以絲氨酸位點最多，有 11個，蘇氨酸和酪氨酸位點分別有 4個和 6個。由此推測 Csδ OAT蛋白的活性可能受到磷酸化作用的調(diào)控。 圖 3 Csδ OAT蛋白磷酸化位點預測 Fig. 3 Phosphorylation site prediction of Csδ OAT protein Csδ OAT的三級結構預測 用 SWISSMODEL對 Csδ OAT蛋白的三級結構進行預測，得到 Csδ OAT蛋白的三維結構。結 果與 Str225。nsk225。等（ 2022）獲得的豌豆 δ OAT蛋白三級結構模型圖相似，均含有 δ OAT典型的 PLP 輔助因子結構，進一步證實獲得的 Csδ OAT 基因編碼蛋白屬于依賴 PLP的鳥氨酸氨基轉移酶。 系統(tǒng)進化樹分析 選擇 17個與茶樹 Csδ OAT 編碼蛋白同源性較高的 δ OAT蛋白序列，利用 MEGA NJ系統(tǒng)進化樹 。如圖 4所示，以 δ OAT分為兩個類群：第 Ⅰ 類為雙子葉植 圖 4 Csδ OAT與其他植物 δ OAT蛋白的系統(tǒng)進化關系 Fig. 4 Phylogeic relatedness among Csδ OAT and other plants δ OAT proteins 2470 園 藝 學 報 41卷 物的 δ OAT進化關系，其中茶樹 Csδ OAT與獼猴桃 Acδ OAT親緣關系最近，可能為直系同源蛋白， 其次為湖北海棠和葡萄，而與煙草和菊芋親緣關系較遠，表明茶樹 Csδ OAT與雙子葉植物中的木本 植物親緣關系較近，而與草本植物的親緣關系較遠；第 Ⅱ 類主要為單子葉植物和裸子植物的 δ OAT 進化關系，其中單子葉植物聚為一簇，表明其由同一祖先進化而來?？傊上到y(tǒng)進化樹分析可以 看出 δ OAT的進化關系與植物形態(tài)學上分類的進化關系較一致，反映了 Csδ OAT蛋白的進化規(guī)律 和物種的親緣關系規(guī)律。 Csδ OAT 的熒光定量表達分析 Csδ OAT 的脅迫處理表達分析 在 NaCl脅迫處理期間，茶樹葉片中 Csδ OAT 基因的表達量從 1 h開始逐漸增加，在 12 h時達 到最高，為對照的 ，之后開始降低，呈現(xiàn)出先上升后降低的變化趨勢（圖 5），表明高鹽脅 迫可以顯著誘導茶樹葉片中 Csδ OAT 基因的表達。 在 ABA誘導處理期間，茶樹葉片中 Csδ OAT 基因的表達量在 1 ~ 8 h表現(xiàn)出緩慢地增加，在 12 h時迅速增加至對照的 ，之后迅速降低到 （圖 5），表 明 ABA可以顯著誘導茶樹葉 片中 Csδ OAT 基因的表達，并表現(xiàn)出爆發(fā)性增加的特點。 圖 5 Csδ OAT 基因在不同脅迫處理下的表達量 Fig. 5 Relative expression of Csδ OAT under different stress treatments 12期 王偉東等：茶樹鳥氨酸轉氨酶基因 Csδ OAT 的克隆與表達分析 2471 在 4 ℃ 低溫脅迫處理期間，茶樹葉片中 Csδ OAT 基因的表達量出現(xiàn)兩次高峰，其中 2 h的表達 量為對照的 ， 12 h的表達量為對照的 ，呈現(xiàn)出先上升后降低再上升再降低的變化趨勢 （圖 5）。 在干旱脅迫處理期間，茶樹葉片中 Csδ OAT 基因的表達量從 1 h開始迅速增加，并在 2 ~ 12 h 維持在較高水平，其表達量約為對照的 ，之后其表達量開始降低，總體呈現(xiàn)出先上升后 降低的變化趨勢（圖 5）。 在 H2O2脅迫處理期間，茶樹葉片中 Csδ OAT 基因的表達量出現(xiàn)兩次高峰，分別為 4 h和 24 h， 其表達量分別為對照 的 ，整體呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的變化趨勢（圖 5），表明 H2O2可以顯著誘導茶樹葉片中 Csδ OAT 基因的表達。 總之，熒光定量 PCR的分析結果表明茶樹 Csδ OAT 基因是一個受高鹽、 ABA、低溫、干旱和 氧化脅迫誘導表達的基因，該基因可能參與了多種逆境脅迫下茶樹葉片的滲透調(diào)節(jié)過程。 Csδ OAT 的組織特異性表達分析 以茶樹根、莖、葉、芽、花和果實的 cDNA為模板進行熒光定量 PCR分析，結果表明 Csδ OAT 在花中的表達量最高，其次為葉片，而在其它組 織中的表達量相當，且相對較低（圖 6）。 圖 6 Csδ OAT 基因在茶樹不同組織中的表達量 Fig. 6 Relative expression of Csδ OAT in different tissues of tea plant 3 討論 植物為應對逆境脅迫而積累可溶性滲透物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿和糖醇等，作為小分子的滲透 保護物質(zhì)，其中脯氨酸是分布最為廣泛的滲透調(diào)節(jié)劑（ McCue amp。 Hanson， 1990）。 δ OAT作為脯氨 酸鳥氨酸合成途徑中的關鍵酶，與植物逆境脅迫響應密 切相關（ Slama et al.， 2022），但在茶樹上 還沒有關于 δ OAT的研究報道。本研究中通過 RACE技術克隆獲得了茶樹的 δ OAT 基因，與其它 植物的 δ OAT具有較高的同源性，其編碼的氨基酸序列含有 δ OAT典型的 PLP結合位點和抑制因 子結合位點，屬于乙酰鳥氨酸氨基轉移酶家族，命名為 Csδ OAT 。對 Csδ OAT蛋白跨膜區(qū)預測顯示 該蛋白可能為跨膜蛋白，磷酸化位點預測結果顯示 Csδ OAT蛋白含有多個磷酸化位點，可能與 Csδ OAT蛋白的活性調(diào)控有關。相關研究表明，磷酸化和去磷酸化 是 ABA信號通路中關鍵性的過 程，低溫、干旱