【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 恒溫水?。?HWS24 型電熱恒溫水浴鍋及 CU600 型電熱恒溫水浴箱 電泳設(shè)備： DYYIII2 穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠 電子天平： DHAUS 電子天平 分光光度計(jì)： UNIC 2802H 分光光度計(jì) 超純水儀：美國(guó) MILLIPORE 公司 凝膠成像系統(tǒng)： UVC 凝膠成像系統(tǒng) 臺(tái)式離心機(jī)： TGL16G，上海安寧儀器廠 低溫離心機(jī)： HETTICH 公司 制冰機(jī)：日本 SANYO 公司 電轉(zhuǎn)儀及配套設(shè)備： BTX ECM399 振蕩器： HZQC 空氣浴振蕩器及 HZX 全溫振蕩器 移液器： l、 10μ l、 100μ l、 1000μ l 量程，均為 Eppendorf 離心管 PCR 管 實(shí)驗(yàn)試劑 DNA 提取試劑盒 RNA 提取試劑盒 瓊脂糖 核酸染料 酒精 固體 Nacl 固體瓊脂 葡萄糖 所用材料 克隆羊胎盤 、 羊毛 實(shí)驗(yàn)方法 瓊脂糖凝膠的配制及電泳 1 稱取 瓊脂糖，至于三角瓶中，加入 50ml 1 TAE 緩沖溶液至于三角瓶中，將該三角瓶置于微波爐加熱至瓊脂糖溶解，將冷卻至 65 度左右的瓊脂糖凝膠液加入 3 微升核酸染料，充分混勻。 2 膠板的制備： 取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干； 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上，安好擋板，放好梳子。 （注意 :再距底板 ~ 的位置放置梳子，如果梳子距離玻璃板 太近，則拔出梳子是孔底有破裂的危險(xiǎn)。） 將溫?zé)岬沫傊侨芤旱谷肽z膜中，使膠液緩慢地展開(kāi)，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。凝膠厚度在 3~5mm 之間，檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。 室溫下靜置 30min 左右待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開(kāi)的上樣孔。 治好膠后將膠放在含有 1TAE 工作液的電泳槽中使用，沒(méi)過(guò)膠面 1mm 以上。 3 加 樣 在點(diǎn)樣板或 parafilm 上混 的 DNA 樣品和上樣緩沖液 上 樣緩沖倍數(shù)應(yīng)不小于 1X 用 10 ul 微量移液器 分別將樣品加入膠板的樣 品小槽內(nèi) ,每 加 完 一 個(gè) 樣品 ,應(yīng) 更 換 一 個(gè) 加 樣 頭 ,以 防 污 染 ,加 樣 時(shí) 勿 碰 壞 樣 品 孔 周圍的凝膠 面 .(注意 :加樣前要先記下加樣的順序 ). 電泳 : 加 樣 后 的 凝 膠 板 立 即 通 電 進(jìn) 行 電 泳 ,電壓 60100V, 樣 品 由 負(fù) 極 (黑色 )向正極 (紅色 ) 方向移動(dòng) ， 電壓升高 ,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低 .當(dāng) 核酸染料 移動(dòng)到 距離膠板 下沿約 1cm 處時(shí) ,停止電泳 . 電泳完畢后 ,取出凝膠 觀察照相 : 在紫外燈下觀察 ,DNA 存在則顯示出紅色熒光條帶 ,采用凝膠成像系 統(tǒng)拍照保存 。 DNA 提取操作步驟： 1. 處理材料 動(dòng)物組織（脾組織用量應(yīng)少于 10mg）應(yīng)先打碎處理為細(xì)胞懸液，然后 10000rpm（ 11200 g） 離心 1min,倒盡上清，加入 200ul 緩沖液 GA 振蕩至徹底懸浮 . 2. 加入 20ulProteinase k 溶液，混勻提取組織基因組時(shí)，加入 Proteinase K混勻后，在 56℃ 放置，直至組織溶解，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，再進(jìn) 行下一步驟，不同組織裂解時(shí)間不同，通常需 1— 3h 即可完成 . 3. 加入 200ul 緩沖液 GB，充分顛倒混勻， 70℃ 放置 10min，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠 . 注意：加入緩沖液 GB 時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般 70℃ 放置時(shí)會(huì)消失，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如溶液未變清亮，說(shuō)明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取 DNA量少和提取出的 DNA 不純。 4. 加入 200ul 無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻 15sec,此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠 5. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中） ， 12022rpm(13400 g)離心 30sec，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 放回收集管中 6. 向吸附柱 CB3中加入 500ul緩沖液 GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12022rpm (13400 g)離心 30sec，倒掉廢液，將吸附柱 放入收集管中 7. 向吸附柱 CB3中加入 700ul漂洗液 PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12022rpm(13400 g)離心 30sec,倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中 . 8. 重復(fù)操作步驟 7 9. 將吸附柱 CB3 放回收集管中， 12022rpm(13400 g)離心 2min,倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液 注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切 PCR 等）實(shí)驗(yàn) . CB3 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50— 200ul洗脫緩沖液 TE，室溫放置 2— 5min,12022rpm (13400 g )離心 2min,將溶液收集到離心管中 . 注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 50ul，體積過(guò)小影響回收效率。洗脫液的 pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫 液應(yīng)保證其 pH 值在 — 范圍內(nèi)（可以用 NaOH 將水的 pH 值調(diào)到此范圍）， pH 值低于 會(huì)降低洗脫效率；且DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在﹣ 20℃ ，以防 DNA 降解。為增加基因組 DNA 的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱 CB3 中，室溫放置 2min,12022rpm(13400 g) 離心 2min. 目的基因的擴(kuò)增（ PCR） DNA 的 PCR 轉(zhuǎn)錄體系 模板 2ul 。 LaTaq 。 10 bufferI 2ul。 Dntps 2ul。 Fg1 1ul。 Rg1 1ul。 H2O 引物 序列： Fg1： CGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTG； Rg1： AGTTCACCTTGATGCCGTTCPCR。 程序： 94℃ 預(yù)變性 5min； 94℃ 變性 50s； 55℃ 退火 1min； 72℃ 延伸 1min； 72℃ 延伸 5min；其中 ② ④ 步循環(huán) 35 次。 擴(kuò)增片段 長(zhǎng)度約 ： 500bp。 RNA 的提取 RNA 的提取操作步驟： 1. 錫紙?jiān)诰凭珶艋鹧嫔献茻? 2. 切取適量大小的山羊胚胎組織于研缽中，研磨時(shí)適時(shí)補(bǔ)充液氮至研成粉末 3. 先稱取離心管重量，將研磨好的粉末倒入離心管中（ 10ml），再稱重取差值，每 200ug 加入 1mlTRL201,加樣式槍頭不要碰壁 4. 充分振蕩離心管（渦旋），室溫靜置 5min. 5. 12022g(RCF)4℃ 離心 5min. 6. 取上清加入新離心管（注意不要吸到下層），分為兩管 . 7. 向上清液中加入 1／ 5 plus 體積的氯仿，蓋緊離心管蓋，手搖劇烈振蕩 15s 8. 12022g4℃離心 15min 9. 從離心機(jī)中小心地取出離心管，此時(shí)液體分為三層，吸上層清液 700ul 到新離心管中 700ul 異丙醇，上下顛倒離心管，充分混勻后在15— 30℃下靜置 10min ℃離心 10min， 75％ 乙醇清洗沉淀 12022g4℃ 10min離心后棄去乙醇 . 室溫干燥 25min，加入 10ulRNA 溶解液，溶解沉淀，測(cè)得 RNA 濃度為, RTPCR 鑒定 RNA 提取完成，迅速利用試劑盒將其反轉(zhuǎn)成 cDNA，以此為模板，用上述引物二擴(kuò)增目的片段，內(nèi)參為 GAPDH。 （ 1）反轉(zhuǎn)錄體系 5PrimeScript Buffer （ for Real Time）， 2181。l； PrimeScriptRT Enzyme MixI，； Oligo dT Primer（ 50181。M）， ； Random 6 mers（ 100181。M）， ； Total RNA， 1181。l2181。l； RNase Free d3H2O 加至 10181。l。 （ 2）反應(yīng)條件 37℃ 15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）， 85℃ 5s（反轉(zhuǎn)錄酶