【文章內(nèi)容簡介】 將已活化好的菌種轉(zhuǎn) 接到平板中，在 35℃ 37℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng) 7 天。 菌懸液的制備 向已培養(yǎng)了 7 天的短小芽孢桿菌的平板加入 2 3mL 無菌蒸餾水，用涂布棒將菌種洗下，轉(zhuǎn)移到滅過菌的錐形瓶里，置于 4℃冰箱里保存?zhèn)溆谩? 培養(yǎng)皿的選擇 培養(yǎng)皿底部不平時，會使培養(yǎng)基厚度不均勻，培養(yǎng)基厚度大，抑菌圈半徑變小，培養(yǎng)基厚度小，抑菌圈半徑大 【 8】 ，容易造成實驗誤差，故應該選擇底部平整，厚度均勻且規(guī)格一樣的培養(yǎng)皿。選擇時，可將培養(yǎng)皿放在水平臺上，底部墊一層白紙，分別加入 34mL 的水，然后滴加藍色墨水，觀察藍色是否深 淺一致，如顏色深淺一致則表示培養(yǎng)皿底部平整 【 9】 。 操作環(huán)境系統(tǒng)的監(jiān)測 操作環(huán)境系統(tǒng)的潔凈度采用沉降菌進行檢測。本次實驗用的是操作室分為兩部分，中間由玻璃門隔開，其中一部分為無菌操作室，另一部分為半無菌操作室，這兩部操作室都設有紫外滅菌燈。將制備好的營養(yǎng)瓊脂倒在 6 平皿里，凝固后，將 1 個平板放在無菌操作室的超凈工作臺上， 2 個平板放在及無菌室里兩個不同的位置，剩下 3 個 平板 放在半無菌操作室的三個不同位置，分別打開平板 30min以上，之后置于 35℃ 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h。 磷酸緩沖溶液的選擇 稱取磷酸氫二鉀 ，磷酸二氫鉀 ，加水蒸餾水 1000mL，制成磷酸緩沖液，用 NaOH 溶液調(diào)整其 pH 值。 2021 版的《中國藥典》規(guī)定效價 硫酸 慶大霉素用的磷酸緩沖溶液 pH=，且不添加任何物質(zhì)。但有文獻表明， 硫酸 慶大霉素微生物的效價測定，高劑量的抑菌圈直徑大小很難達到 1822mm，在 6 之內(nèi)，其抑菌圈的大小隨緩沖液 pH 值的增大而增大，且在緩沖液中加入 4%以上的氯化鈉，直徑能達到 1822mm 這個范圍 【 10】 。為了選擇最適條件的磷酸緩沖液， 本實驗做了兩組對照， 一組 pH 值為 不滴加 NaCl 與滴加 NaCl的磷酸緩沖液，另一組 pH 值為 不滴加 NaCl 與滴加 NaCl 磷酸緩沖液。 平均裝量 傾出供試品 硫酸 慶大霉素膠囊的內(nèi)容物迅速稱量，記錄每粒膠囊的重量，每個批號分別稱量 10 粒，并計算每個批號的平均裝量。 表 3 供試品的平均裝量 顆粒 樣 1/g 樣 2/g 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均裝量 標準品與供試品溶液的制備 抗生素吸濕性很強，稱量的時候很容易吸收操作環(huán)境空氣中的水分而影響精確度，稱量時 要用精確度達到 1/10 萬的分析天平 快速一次性稱量， 稱量完后立即將藥品蓋好，以免吸水。藥品的稱樣量可根據(jù)海南普利制藥有限公司質(zhì)檢部提供的公式計算： 稱樣量 =（ R 638u/mg平均裝量）／標示量。 7 R：一般取值為 1 638u/mg：是指藥品要達到 15000 個單位 標準品溶液的制備 標準品的標示量 是 ，要達到 15000 個單位需要稱量 。稱量前，先 將標準品從 4℃冰箱取出，置于室內(nèi)待其溫度與室溫平衡后，再稱量 用 50mL 容量瓶加超純水定容至 50mL。充分混勻后，取 2mL 標準品溶液分別用 100mL 和 50mL 裝量的磷酸緩沖液稀釋成高濃度為 12u/mL、低濃度為6u/mL 的標準溶液，稀釋前，先將已配制好的磷酸緩沖液潤洗要稀釋用的容量瓶，量取過濾液的吸管要用過濾液潤洗 23 次。 供試品溶液的制備 樣 1 的平均裝量是 ,樣 2 的平均裝量是 ，代入以上公式得樣 1 稱樣量 =，樣 2 稱樣量 =。重新拿新的膠囊進行稱量，避免藥品吸收水分而影響結果，稱量好后分別裝入 50mL 容量瓶加超純水定容至 50mL,并用濾紙過濾收集液體，收集液體用的器皿要用過濾液潤洗。標準品和供試品所用的磷酸緩沖液應是同一瓶，防止?jié)舛然?pH 值不一樣而影響實驗結果。稀釋時和標準品操作方法一樣，需要用磷酸緩沖液潤洗要稀釋用的容量瓶和量取過濾液的吸管，分別取 2mL 標準品溶液分別用 100mL 和 50mL 裝量的磷酸緩沖液稀釋成高濃度為 12u/mL、低濃度為 6u/mL 的樣液。 雙碟的制備 試驗菌濃度的確定 由于實驗過程中是用平板培養(yǎng)試驗菌，沖洗時沒有固定無菌水的用量，在制備菌層培養(yǎng)基時無法確定試驗菌的濃度，所以可通過加最適量的菌懸液來取得最佳 結果。 200mL 培養(yǎng)基加菌量范圍是 【 11】 ,故可先測試培養(yǎng)基加菌量 分別 為 、 4mL、 、 5mL 所 形成的抑菌圈效果哪個最好，選出最適加菌量。 制備底層培養(yǎng)基 從無菌操作室里選擇一個較平的超凈工作臺，如果超凈工作臺面凹凸不平，可以 在操作臺上放置一塊大的玻璃板，以保證放置平皿的位置平整。加注底層培 8 養(yǎng)基前，先將滅過菌的培養(yǎng)皿底部平均劃分為 4 個區(qū)域，分別標注上 標準品和供試品的 高低濃度，之后用 10mL 的滅菌大口移液管吸取 20mL 培養(yǎng)基加注到平整培養(yǎng)皿里，作為底層培養(yǎng)基。加注時避免培養(yǎng)基溫度太低，防止培養(yǎng)基內(nèi)部結塊而影響培養(yǎng)基表面水平。 制備菌層培養(yǎng)基 將已滅菌的 200mL 裝量的培養(yǎng)基加熱融化后冷卻，注意培養(yǎng)基溫度過高會使菌種致死，導致無圈或者 抑菌圈 破圈。細菌一般是冷卻到 48℃ 50℃，芽孢可冷卻到 60℃左右 【 12】 ，加入已經(jīng)制 備 好的短小芽孢桿菌 菌懸液 ,搖勻。用滅菌的 10mL 大口移液管吸取含有菌液的培養(yǎng)基 5mL，注入到底層培養(yǎng)基上，輕輕晃動，使 含有菌液的 培養(yǎng)基均勻的平鋪在底層培養(yǎng)基上，置超凈工作臺上待凝固備用。 放置牛津杯 用鑷子將已滅菌的牛津杯等距離的放置到制備好的雙碟培養(yǎng)基上，放置后，靜置 510min，再滴加標準品和供試品溶液。 滴加抗生素 每批供試品至少準備 6 個雙碟，用滅過菌的膠頭滴管滴加抗生素溶液，滴加前先用滴加液潤洗 23 次。按已經(jīng)劃分好的區(qū)域滴加，滴加順序為SH→TH→SL→TL，也可以是 SL→TL→TH→SH（ S：標準品， T：供試品， H：高濃度， L：低濃度），但由于抑菌圈測定儀系統(tǒng)固定的檢測順序是 TH→SH→TL→SL,故本次實驗的添加順序沒有按藥典規(guī)定的順序添加，而是根據(jù)抑菌圈測定儀檢測順序 TH→SH→TL→SL 添加抗生素 ，最終都不會影響檢測結果。滴加的溶液應與鋼管口平滿，如果過滿，需 用膠頭滴管輕微吸取多余的部分，且滴加抗生素的時間間隔不能太長，會引起抗生素擴散的時間不同而影響實驗結果。滴加時膠頭滴管如果有氣泡或開口端有液體殘留時，應重新吸取溶液滴加，避免滴加過程氣泡破裂或 濺落使培養(yǎng)基表面破圈。滴加完畢后，輕輕的將雙碟平穩(wěn)放入 35℃ 37℃培養(yǎng)箱，放置雙碟時應保持一定的距離，以免受熱不均勻影響抑菌圈的大小，最后用滅過菌的陶瓷蓋蓋住雙碟，培養(yǎng) 1618h【 13】 。 9 抑菌圈測定儀的使用 檢查：檢查軟件鎖、掃描儀數(shù)據(jù)連接線均已正確連接上電腦的 USB 接口，掃描儀的安全鎖均處于開鎖狀態(tài)且掃描儀電源處于打開狀態(tài)； 打開：插上測定儀的密鑰，在桌面上找到抑菌圈自動測定的快捷方式，點擊打開； 設置：打開設置頁面，將成像方式選擇掃描儀，選擇六皿； 標定：選擇標定中的掃描時自動標定， 系統(tǒng)會自動根據(jù)掃描的分辨率將圖像尺寸與實際大小進行對應； 掃描及分析：用酒精擦掉平皿底部劃分的區(qū)域，分別在雙碟邊緣上標出標準品的位置，然后選出 6 個雙碟按一定順序安置在掃描儀上進行掃描，調(diào)整好每個目標區(qū)的大小及位置，選擇“六皿抑菌