【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ，通 過(guò)證明其具有抗氧化能力來(lái)說(shuō)明原花青素在抗衰老、護(hù)膚等方面是有功效的。因此為藥理學(xué)、生命科學(xué)研究等方面提供一點(diǎn)理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。 1 材料與方法 試劑與儀器 試劑 沒(méi)食子酸 生物試劑 中國(guó)藥品生物檢定所 兒茶素 生物試劑 中國(guó)藥品生物檢定所 乙醇 分析純 江蘇省宜興市興洋企業(yè) 濃鹽酸 分析純 溫州天盛電化有限公司 香草醛 分析純 青島裕達(dá)精細(xì) 化工有限公司 甲醇 分析純 江蘇省宜興市興洋企業(yè) NaHCO3 分析純 上海四星醫(yī)藥科技工貿(mào)公司 Folinclocalteau 分析純 Sigma 公司 兒茶素，沒(méi)食子酸 分析純 Sigma 公司 蓮房，蓮子殼， 分析純 Sigma 公司 器材與儀器 722 分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司 14 微波爐 LG 電子（天津）電器有限公司 恒溫烘箱 101A－ 3S 上海意豐電爐有限公司 電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司 大小燒杯、錐形瓶若干、不同規(guī)格的離心管、滴管、移液管、玻璃 棒、移液槍等。 實(shí)驗(yàn)方法 蓮房的預(yù)處理：將蓮房篩選除去雜質(zhì)后粉碎過(guò) 60 目篩，用正己烷脫脂后待用。 總酚含量的測(cè)定 Folinclocalteau 法。配制試劑：稀釋十倍的 Folinclocalteau 原液試劑及15%的碳酸鈉溶液。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取沒(méi)食子酸 用水溶解并定容到 10mL 得，精確吸取對(duì)照樣品溶液 、 、 、 、 、 于 10mL 容量瓶中，再加入 1mL Folinclocalteau 試劑，搖勻后再加入 2mL 15%碳酸鈉溶液，定容到 10mL，室溫下反應(yīng) 2 小時(shí)后測(cè)定 A760，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 提取液中總多酚含量的測(cè)定：移取待測(cè)提取液 于 10mL 容量瓶中，依次假如 Folinclocalteau（稀釋后）顯色劑及 2mL 15%碳酸鈉溶液并定容，反應(yīng) 2h 后測(cè)定（ A760）吸光度值 ,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚的沒(méi)食子酸當(dāng)量，并計(jì)算提取得率。 原花青素含量的測(cè)定 香草醛 濃鹽酸法 . 配制試劑： 。精確稱取 香草醛 （香蘭素）固體溶解到 50mL 甲醇中，混勻待用。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取兒茶素（對(duì)照品） 用去離子水定容到 ，得 。用移液管移取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液 、 、 、 、 、 ,用去離子水定容到 10mL 得不同濃度的對(duì)比溶液。依次移取 的對(duì)比溶液到對(duì)應(yīng)的容量瓶中，再依次加入 香草醛 甲醇， 濃鹽酸，混合均勻后在水浴鍋中 20℃反應(yīng) 15 分鐘。以 15 香草醛 甲醇、 濃鹽酸、 甲醇的混合液作為空白對(duì)照，在 500nm 處測(cè)吸光度值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。 單因素實(shí)驗(yàn) 溶劑選擇 精密稱取 4 份 的蓮房粉放入 100mL 的燒杯中，微波功率一定，料液比一定，微波作用一定時(shí)間，以提取綠為衡量標(biāo)準(zhǔn)，考察不同溶劑 [70%的丙酮、70%的乙醇、 70%的甲醇和水（加入亞硫酸氫鈉 1%） ]對(duì)總多酚和原花青素提取效果的影響，確定一種作為后續(xù)溶劑。 溶劑濃度的選擇 精密稱取 7 份 的蓮房粉放入錐形瓶中，加入一定濃度，一定料液比的溶劑，微波功率一定，萃 取時(shí)間一定，考察不同濃度溶劑（ 20%、 30%、 40%、50%、 60%、 70%、 80%、）對(duì)提取效果的影響然后進(jìn)行多酚和原花青素提取綠的影響。 微波作用時(shí)間的影響 精密稱取 7 份 的蓮房粉放入錐形瓶中，以選定溶劑為提取劑，微波功率一定 (80%輸出功率 )，料液比一定，微波作用一定時(shí)間后一提取綠為衡量指標(biāo)，考察了微波作用時(shí)間（ 30s、 40s、 50s、 60s、 70s、 80s、 90s、 100s）對(duì)總酚和原花青素提取效果的影響。 微波萃取功率的影響 精密稱取 5 份 的蓮房 粉放入 100mL 的燒杯中，以選定溶劑為提取劑，一定料液比，微波作用 50s 后，以提取綠為衡量指標(biāo)，考察了微波功率（ 20%、40%、 60%、 80%、 100%）對(duì)總酚和原花青素提取效果的影響。 料液比的影響 精密稱取 5 份 的蓮房粉放入錐形瓶中，以選定溶劑為提取劑，微波功率為中火（ 80%功率）微波作用時(shí)間 90s 后，以提取率為衡量指標(biāo)考察了料液比（ 1： 1： 1 1： 1： 2 1： 1： 35（ M/V））對(duì)總酚和原花青素提取效果的影響。 萃取次數(shù)的 影響 精密稱取 4 份 的蓮房粉放入錐形瓶中，以選定溶劑為提取劑，料液 16 比為一定，微波功率為中火（ 80%功率），微波處理 90s,以提取率為指標(biāo)，考察了提取次數(shù)（ 4 次）對(duì)總酚和原花青素提取效果的影響。 pH 值對(duì)萃取得率的影響 精密稱取 6 份 的蓮房粉，置于 250mL 三角瓶中，加入適量的選定溶劑，用 5moL/l 鹽酸來(lái)調(diào)節(jié) pH 分別為 7，于室溫下浸提，以提取率為衡量指標(biāo)，對(duì)總酚和原花青素提取效果的影響。 正交實(shí)驗(yàn) 精確稱 取蓮房粉 9 份，每份 1 g，置于三角瓶中，按 L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)浸提條件，提取過(guò)濾、離心合并濾液，于真空條件下濃縮回收酒精，濃縮樣品，定容，測(cè)定蓮房多酚和原花青素的含量。 水平 因素 溶劑容度 A 萃取功率 B 萃取時(shí)間 C 料液比 D 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 2 結(jié)果與分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線 00 吸光度值濃度(mg/mL)： 圖 1 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig1 Total phenol standard curve y（總酚） =+ R2 = 17 00 吸光度值濃度(mg/mL) 圖 2 原花青素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig2 Proanthocyanidins content standard curve y（ 原花青素） = + R2 = R 值都在 以上，滿足線性回歸。得回歸方程為 y=ax+b(其中 y 為沒(méi)食子酸的含量 mg， x 為吸光度值 ) 單因素實(shí)驗(yàn) 溶劑選擇 01234567870%甲醇70%乙醇70%丙酮1%亞硫酸氫鈉溶劑得率（%)原花青素 總酚 圖 3 溶劑選擇 Fig3 Solvent choice 如（圖 3）所示，在所有實(shí)驗(yàn)中，用丙酮作為萃取劑的組不論是原花青素得 18 率還是總酚得率，其數(shù)值都高于其他溶劑，因此與之相比丙酮是比較理想的萃取劑。 溶劑濃度選擇 0246810120% 20% 40% 60% 80% 100%溶劑濃度得率（%)原花青素 總酚 圖 4 溶劑濃度選擇 Fig4 Solvent concentration choice 如（圖 4）所示，用不同濃度的丙酮作為萃取劑，原花青素和總酚的得率都是在丙酮濃度在 60%是達(dá)到最大值。 微波作用時(shí)間的影響 0123456780 20 40 60 80 100 120微波作用時(shí)間（s )得率（%)原花青素 總酚 圖 5 微波作用時(shí)間的影響 Fig5 Microwave time of Impact 19 在其它條件相同的情況下，考慮微波作用時(shí)間的不同對(duì)原花青素和總酚得率的影響，如（圖 5）所示，當(dāng)微波作用時(shí)間定為 90s 時(shí)，其得率是最高的。 微波萃取功率的影響 01234567890% 20% 40% 60% 80% 100% 120%微波功率得率（%g)原花青素 總酚 圖 6 微波萃取功率的影響 Fig6 Microwave Power Extraction of Impact 在其它條件不變的情況下考慮通過(guò)改變微波的輸出功率對(duì)原花青素和總酚的得率的影響。如（圖 6）所示，當(dāng)把微波的輸出功率調(diào)整到 80%（即 560W）時(shí)，原花青素和總酚的得率達(dá)到最高 值。 料液比的影響 012345671:10 1:15 1:20 1:25 1:30 1:35料液比得率（%）原花青素 總酚 圖 7 料液比的影響 Fig7 Feed ratio of Impact 20 在微波輸出功率，微波作用時(shí)間都一定時(shí)，通過(guò)調(diào)整料液比來(lái)觀察其對(duì)原花青素和總酚得率的影響。如（圖 7）所示當(dāng)料液比為 1： 25 時(shí)，兩者的得率都在同條件下達(dá)到最高。 萃取次數(shù)的影響 012345670 1 2 3 4 5萃取次數(shù)得率（%)原花青素 總酚 圖 8 萃取次數(shù)的影響 Fig8 Extraction number of Impact 如（圖 8）所示，當(dāng)萃取次數(shù)達(dá)到 3 次以后，原花青素和總酚的得率都趨于平行，表明再做多余的萃取次 數(shù)已經(jīng)沒(méi)有必要了。 pH 值的影響 01234560 1 2 3 4 5 6 7 8pH值得率(%)原花青素 總酚 圖 9 pH 值的影響 Fig9 pH Value of Impact 21 通過(guò)調(diào)整溶劑的 pH 值來(lái)觀察其對(duì)兩者的得率的影響，如（圖 9）所示 pH值對(duì)總酚的影響不大，而且當(dāng) pH 值調(diào)整為 5 時(shí)，兩者的得率都是最高的。 正交實(shí)驗(yàn) 通過(guò)以上單因素實(shí)驗(yàn)，以溶劑濃度、微波輸出功率、微波作用時(shí)間和料液比為四個(gè)考察因素，做四因素三水平（ L9(34)）的正交實(shí)驗(yàn)，如（表 1）、（表 2） 表 1 原花青素正交實(shí)驗(yàn)表 Tabie1 Proanthocyanidins orthogonal Table 試管號(hào) 因素 原花青素得率 丙酮濃度 微波功率 微波作用時(shí)間 料液比 （ %） 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 K1 K2 K3 k1 k2 k3 表 2 總酚正交實(shí)驗(yàn)表 Table2 Total phenol orthogonal Table 試管號(hào) 因素 總酚得率 丙酮濃度 微波功率 微波作用時(shí)間 料液 比 （ mg/g) 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 22 K1 K2 K3 k1 k2 k3 重復(fù)實(shí)驗(yàn) 02468101214原花青素 總酚得率重復(fù)試驗(yàn)得率（%) 圖 10 重復(fù)實(shí)驗(yàn) Fig10 Repeat experiments 經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳的微波輔助提取原花青素的 條件是，控制微波作用時(shí)間為 90s，微波的輸出功率為 80%（即 560W），并且配制丙酮濃度為 60%，料液比為 1： 25（ 1g:25mL），通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，利用最佳的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的原花青素和總酚的得率是所有單因素實(shí)驗(yàn)中最高的。 水提原花青素的單因素實(shí)驗(yàn) 微波作用時(shí)間的影響 23 0123456730 40 50 60 70 80 90 100 110微波作用時(shí)間（s )得率（%)蓮房 蓮子殼 圖 11 微波作用時(shí)間的影響 Fig11 Microwave time of Impact 在對(duì)單因素 時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，如圖 11 所示，微波作用時(shí)間定為 90s 時(shí)原花青素和總酚的得率都達(dá)到其它條件相同下 的最高值。 微波萃取功率的影響 0123456780% 20% 40% 60% 80% 100% 120%微波功率得率（%)蓮房 蓮子殼 圖 12 微波輸出功率的影響 Fig12 Microwave Power Extraction of Impact