【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 油茶三萜皂苷 （ 1） 配制洗脫液：二氯甲烷：甲醇：水 =65:50:8。 （ 2） 裝柱：稱(chēng)取硅膠（ 100200 目），柱 ③ (100 cm) 478 g、柱 ④ (100 cm) 522 g，分別用適量洗脫液浸泡并攪拌均勻趕出氣泡。裝柱前先在柱內(nèi)倒入部分洗脫液作為緩沖，裝柱時(shí)要一氣呵成，否則會(huì)有斷層。分別量取 2500 ml 的洗脫液循環(huán)沖柱，使硅膠壓的更緊實(shí)，最終硅膠柱高約 80 cm。 （ 3） 拌樣：各稱(chēng)取 15 g 樣品 A 于小燒杯中，加少量甲醇溶解，再各稱(chēng)取 15 g 硅膠于研缽中，放于水浴鍋（ 60℃ ）上， 將溶解的樣品緩慢倒入并攪拌均勻，加熱后得到干物質(zhì)共 63 g，研成粉末。 （ 4） 濕法上樣： 將上步研磨得到的粉末裝柱， 柱 ③ g、柱 ④ g，再 7 在樣品上各加 10 g 硅膠，防止倒入緩沖液時(shí)沖起樣品。注意硅膠和樣品的鋪面一定要平整，這樣 才能使樣品中的洗脫物 均勻下沉。 （ 5） 洗脫：待含顏色的物質(zhì)接近旋鈕口時(shí)開(kāi)始收集流出液（每 500 ml 一組），并做好標(biāo)注。 （ 6） 干燥：每組分別進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直到流出液蒸發(fā)后無(wú)明顯物質(zhì)為止，每根柱子各沖出 15 個(gè)組分。最后將所有組分水浴濃縮、冷凍干燥得樣品 B。 （ 7） 點(diǎn)板 顯色：從中選出質(zhì)地均勻、顏色較淺的組分，各取少許經(jīng)甲醇溶解后用毛細(xì)管吸取適量點(diǎn)在硅膠板一側(cè)，注意點(diǎn)的大小和顏色，各組分所點(diǎn)的大小要均勻一致，點(diǎn)的顏色較淺時(shí)要多點(diǎn)一些。用吹風(fēng)機(jī)吹干后將硅膠板放于裝有緩沖液（二氯甲烷：甲醇：水 =65:50:8）的密封瓶中層析，再次吹干后均勻地噴上顯色劑，最后放于電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱中以 120℃ 加熱顯色約 1 min。顯色劑的配制：稱(chēng)取 g 硫酸鈰溶于 50 ml 濃度為 10%的硫酸溶液中。觀察顯色程度，用作分組參考。 硅 膠柱二次分離油茶三萜皂苷 （ 1） 裝柱：在樣品 B 中， 每根柱子的 2 號(hào)組分質(zhì)量最多且質(zhì)地均勻、色澤較淺，柱 ③ 2 為 g、柱 ④ 2 為 g。重裝兩根硅膠柱（柱 ⑤ 、柱 ⑥ ），每根柱用 430 g 硅膠（ 200300 目）。 （ 2） 洗脫：緩沖液配制為二氯甲烷：甲醇：水 =65:50:6，裝柱后用緩沖液洗脫柱子，待硅膠柱壓緊實(shí)后測(cè)得兩根柱子都高約 72 cm。 （ 3） 濕法上樣：分別將柱 ③ 柱 ④ 2 組分 用甲醇溶解，經(jīng)有機(jī)膜過(guò)濾后各用 7 g 硅膠拌樣， 分別 上樣 后每根柱子加 10 g 保護(hù) 硅膠 。 （ 4） 干燥：用緩沖液沖至流出液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后無(wú)明顯物質(zhì)為止，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥后 ，柱 ⑤ 得 9 個(gè)組分（共 g）、柱 ⑥ 得 8 個(gè)組分 (共 g)。 （ 5） 液相分析：挑選色澤較白、質(zhì)地均勻的組分進(jìn)行液相分析。 ODSC18OPN 分離純化油茶三萜皂苷 （ 1） 樣品 選擇 ：經(jīng)液相分析后，通過(guò)觀察比較各組分樣品的液相圖進(jìn)行分組，將柱 ⑤ 3 至 ⑤ 7 和柱 ⑥ 1 至 ⑥ 7 合并（共 g）。防死吸附：用甲醇溶解，經(jīng)濾紙抽濾和有機(jī)膜過(guò)濾后先 用少量 C18 分離 ，防止死吸附現(xiàn)象，避免污染后面的整根 ODSC18OPN 柱，以純甲醇為洗脫液，將流出液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮、有機(jī) 8 膜過(guò)濾 后 得到備 用樣品溶液（ 60 ml）。 （ 2） 裝柱：將 C18( g） 裝柱，先用純甲醇沖 洗 柱 子 使其更加緊實(shí)，再用 50%濃度的甲醇將柱內(nèi)純甲醇置換出，將樣品溶液分四次上樣。 （ 3） 洗脫：分別用 50%、 60%、 65%、 70%、 100%濃度的甲醇梯度洗脫，每梯度 400 ml，將柱 ⑤ 、柱 ⑥ 剩余組分合并作為第 5 次上樣，每次上樣前 需 將ODSC18OPN 柱沖成 50%的甲醇濃度 ， 從而使柱內(nèi)溶液濃度與第一個(gè)洗脫梯度的濃度相同， 各 收集 5 個(gè)組分 。 （ 4）干燥： 將最終沖出的 25 個(gè) 組分別進(jìn)行 旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā) 、 水浴鍋濃縮和 冷凍干燥 后得到樣品 C。 （ 5）液相分析： 將 得出的 固體 組分 進(jìn)行 液相分析 ，得到的液相分析圖 作 為下一步中樣品選擇的依據(jù) 。 ODSC18OPN 二次分離純化油茶三萜皂苷 （ 1） 樣品合并：從樣品 C 中選出組分 1 2 3 44 合并（共 g），并用甲醇溶解，有機(jī)膜過(guò)濾。 （ 2） 洗脫：將上步所用的 ODSC18OPN 柱 用 50%的甲醇 飽和 ，上樣后分別用 60%(450 ml)、 65%（ 600 ml）、 100%（ 600 ml）濃度的甲醇梯度洗脫，流出液需分組收集， 60%的流出液全部收集為一組； 65%的流出液分 3 組收集 ，每組 200 ml； 100%的先收 200 ml ， 剩余的為一組，共得出 6 個(gè)組分。 （ 3）干燥： 將所得的 6 個(gè) 組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥后共得 g 樣品。 （ 4）各組分的 HPLC 分析。 HPLC 分離純化 通過(guò)觀察經(jīng) ODSC18OPN 柱分離純化后所得組分的液相分析圖判斷油茶三萜皂苷的分離純化程度，選擇峰 較明顯、峰的數(shù)量較少的組分 進(jìn)一步進(jìn)行 HPLC分離純化 。 HPLC 條件： Aglilent Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm mm, 5 μm)色譜柱 ，檢測(cè)波長(zhǎng)： 280 nm，柱溫箱溫度設(shè)定： 25℃ ，流速 mL∕min， A 相：%乙酸， B 相：乙腈， 010min B 相由 35%升至 38%， 20min 升至 42%。 2 結(jié)果與分析 油 茶三萜皂苷分離純化 流程圖 9 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凝干燥 柱 ⑥ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凝干燥 柱 ⑤ 油茶三萜皂苷 粗樣 900 g 蒸餾水浸泡 AB8 大孔樹(shù)脂（柱 ① ： 1100 g；柱 ② :540 g）吸附 柱 ① ： L 柱 ② : L 柱 ① ： L 柱 ② : L 柱 ① ： L 柱 ② : L 柱 ① ： L 柱 ② : L 水、乙醇（ 30%、 80%、 95%）梯度洗脫 蒸餾水洗脫 30%乙醇洗脫 80%乙醇洗脫 95%乙醇洗脫 棄去（蛋白、色素、 黃酮類(lèi)） 得 油茶三萜皂 苷 粗樣 149 g,取30 g 棄去（色素、糖類(lèi)） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凝干燥 每 500 ml 一個(gè)組分，共 30 個(gè)組分 （柱 ③ ： 15 個(gè) 。柱 ④ 15 個(gè)） : 洗脫液： CH2Cl2:CH3OH:H2O (65:50:8） 甲醇溶解， 30 g 硅膠拌樣， 1 kg 硅膠（ 100200 目）濕法裝柱 (柱 ③ ： 478 g。柱④ :522 g) ))洗脫液浸泡，攪勻裝柱 fr1 g 咖啡色粉末 fr2fr5 g 黃白色粉末 fr6fr10 g 棕色粉末 fr11 g 淺棕色粉末 fr12fr15 g 深棕色粉末 柱 ③ 柱 ④ fr1 g 咖啡色粉末 fr2fr4 g 黃白色粉末 fr5fr11 g 棕色粉末 fr12fr15 g 深棕色粉末 洗脫液： CH2Cl2:CH3OH:H2O (65:50:6） 洗脫 每 500 ml 一個(gè)組分，共 9 個(gè)組分 柱 ③ fr2: g，甲醇溶解， 7 g 硅膠拌樣， 430 g 硅膠（ 200300 目）濕法裝柱（柱 ⑤ ） fr1fr2 黃色粉末 含部分晶體 fr3 米白色粉末 fr4fr6 黃白色粉末 fr7fr9 淺黃色粉末 洗脫液： CH2Cl2:CH3OH:H2O (65:50:6） 洗脫 每 500 ml 一個(gè)組分，共 8 個(gè)組分 柱 ④ fr2: g，甲醇溶解， g 硅膠拌樣， 430 g 硅膠（ 200300 目）濕法裝柱（柱 ⑥ ） fr1 黃色粉末 fr2 米白色粉末 fr3fr5 黃白色粉末 含部分晶體 fr6fr8 淺黃色粉末 含部分晶體 10 本研究 以 油茶三萜皂苷 粗品為原料，分別經(jīng)過(guò) AB8 大孔樹(shù)脂初步純化、硅膠（ 100200 目）分離純化、硅膠（ 200300 目）二次分離純化、 ODSC18OPN分離純化、 ODSC18OPN 二次分離純化 、 HPLC 分離純化 后得到 油茶三萜皂苷單體組分。 AB8 大 孔樹(shù) 脂純化油茶三萜皂苷 油茶三萜皂苷 粗品 900 g，經(jīng)過(guò) AB8 大孔樹(shù)脂初步純化后得到 149 g 樣品，其得率為 %。圖 1 中 A 組為 AB8 大孔樹(shù)脂純化前的樣品 ， B 組為純化后，柱 ⑤ 3 至 ⑤ 7 和柱 ⑥ 1 至 ⑥ 7 合并（共 g） ,甲醇溶解，過(guò) ODSC18OPN 柱 ,分 4 次上樣 分別用 50%、 60%、 65%、 70%、 100%的甲醇梯度洗脫，每梯度 450 ml fr1: g 淺棕黃色粉 fr2: g 米白色