分子生物學實驗基礎(chǔ)知識(doc15)-經(jīng)營管理(編輯修改稿)
2024-09-20 14:40 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 胞（大腸埃希菌），使目的基因隨載體在細胞內(nèi)復制、擴增。實驗步驟介紹如下： 圖 183 基因重組方案之一 ⒈大腸埃希菌的處理（增加細胞膜通透性，便于基因進入細胞）大腸埃希菌（ cells）接種于 Lb agar 培養(yǎng)基， 37℃ 培養(yǎng)一晚。挑選 3~5 個大菌落，接種于 50ml LB 培養(yǎng)基， 37℃ ，振搖培養(yǎng)一晚后，在 A550測定，要求細菌繁殖一定量（一般為細菌對數(shù)生長期），野生型（ rec＋， 5x107cells/ml）為 ，缺陷型（ rec， 5x107cells/ml）為 。離心棄去上清液，用 20ml， 50mmol/L， CaCl2懸浮菌體。冰浴 20 分鐘，低溫離心。棄上清液，用 50mmol/l CaCl2懸浮。 4℃ 可保存 48 小時，用于轉(zhuǎn)化，稱 petent cells。 ⒉質(zhì)粒（如經(jīng)基因重組建立的重組質(zhì)粒，基因庫等）的轉(zhuǎn)化 將 competent cells（以美國 BRL 公司 DH10B 菌株為例）置冰水浴。同時將 Falcon2059（傳熱系數(shù)穩(wěn)定）塑料試管置冰水浴。取 100μl 菌液（ DH10B）于 2059 試管中，加 10 倍稀釋 的巰基乙醇 1μl，冰浴輕搖 2 分鐘，放置 10 分鐘。取 質(zhì)粒加入試管，輕輕搖勻，冰浴 30 分鐘。此間備好 42℃ 水浴。并將 SOC 培養(yǎng)基置 42℃ 備用。將試管置于 42℃ ，輕搖 45 秒鐘，馬上置冰浴 2 分鐘。使 petent cells 熱脹冷縮，把質(zhì)粒導入菌體。加 42℃ SOC 培養(yǎng)基 于試管， 37℃ 培養(yǎng) 1 小時。 1000rpm 離心 10 分鐘，棄上清液，用 200μlSOC 培養(yǎng)基懸浮菌體。接種于 LB氨芐青霉素（ 100U/ml）培養(yǎng)皿，37℃ 培養(yǎng)一晚。已轉(zhuǎn)化的菌體可形成菌落（因質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了 解目的基因或其產(chǎn)物的基礎(chǔ)上對菌落進行鑒定。并在 LB 培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)?；驇斓慕?、轉(zhuǎn)化、篩選、擴增、純化的過程就是基因克隆的過程。 LB 培養(yǎng)基（ 1L）： 10g蛋白胨， 5g 酵母膏， 10g NaCl，高壓滅菌， 。 SOB 培養(yǎng)基（ 1L）： 20g蛋白胨， 5g 酵母膏， NaCl，高壓滅菌。另外準備 2mol/L 鎂溶液（ 1mol/L 氯化鎂與 1mol/L 硫酸鎂等量混勻，過濾滅菌），臨用前加 1ml于 100ml 培養(yǎng)基。 SOC 培養(yǎng)基（ 100ml）：臨用前加入 1ml 過濾滅菌的 2mol/L 葡萄糖。 四、核酸的分離與純化 核酸存在于多種細胞，如病毒、細菌、寄生蟲、動植物細胞；多種標本中，如血液、組織、唾液、尿液等其它來源的標本。因此分離方法復雜而多樣。又因各種 DNA、 RNA 的豐度差異，各種分析方法對核酸的純度與量的要求有差異，因此在實驗前應對采用的方法有所了解和選擇?？偟恼f來核酸的分離與純化是在溶解細胞的基礎(chǔ)上，利用苯酚等有機溶劑抽提（核酸溶于緩沖液，即水相），分離，純化；乙醇、丙酮等有機溶劑沉淀，收獲。溶解細胞的方法因標本不同而不同，有用 SDS 加 NaOH，有用蛋白酶，有的用超聲波破碎等方法，苯酚 提取主要使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機相，而核酸保留在水相，達到分離核酸的目的。實驗上生物標本中含量最多的就是蛋白質(zhì)。為了除去分離過程中殘留的有機溶劑，常用的方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸，通過離心回收核酸，然后用 70％ 80％乙醇洗滌沉淀，除去多余的鹽，以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反應。為了得到純的核酸可用蛋白酶除去蛋白，用 RNA 酶除去 RNA，得到純的 DNA，用 DNA 酶除去 DNA 而獲得 RNA。目前開發(fā)了許多商品化的核酸分離柱，可簡單、快速地分離得到純度很高的 DNA 或 RNA。其分離原理有的利用核酸的分子量差異， 有的利用需分離核酸的特點與其特異性結(jié)合達到分離、回收的目的。 （一）質(zhì)粒的分離與純化 含質(zhì)粒的 E. Coli cells 經(jīng) LB
醫(yī)療健康相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1