分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)(doc15)-經(jīng)營(yíng)管理-全文預(yù)覽
【正文】 膠濃度（％）： DNA 長(zhǎng)度（ kb）： 605 201 電泳緩沖液： X50TAE(ml) EB(μl) 總體積(ml) 20 30 1000 X50TAE： Trisma base 54g；乙酸 ； EDTA pH8.0 20ml；蒸餾水至 1000ml。按 1μg DNA 加 25U 限制性內(nèi)切酶，1/10 體積緩沖液， 12 小時(shí)保溫。加適量（約 200μl） TE 溶解。取上層液加酚 /CIAA 重復(fù)一次。 4℃ ， 10000rpm 離心 5min，棄上清液。沉淀蛋白質(zhì)。加 lysis buffer(50mmol/L Glucose， 10mmol/l EDTA， 25mmol/l TrisHCl， )12ml 使之懸浮。其分離原理有的利用核酸的分子量差異， 有的利用需分離核酸的特點(diǎn)與其特異性結(jié)合達(dá)到分離、回收的目的。實(shí)驗(yàn)上生物標(biāo)本中含量最多的就是蛋白質(zhì)。因此分離方法復(fù)雜而多樣。 SOB 培養(yǎng)基（ 1L）： 20g蛋白胨， 5g 酵母膏， NaCl，高壓滅菌。在了 解目的基因或其產(chǎn)物的基礎(chǔ)上對(duì)菌落進(jìn)行鑒定。加 42℃ SOC 培養(yǎng)基 于試管， 37℃ 培養(yǎng) 1 小時(shí)。此間備好 42℃ 水浴。 ⒉質(zhì)粒（如經(jīng)基因重組建立的重組質(zhì)粒，基因庫(kù)等）的轉(zhuǎn)化 將 competent cells（以美國(guó) BRL 公司 DH10B 菌株為例）置冰水浴。離心棄去上清液，用 20ml， 50mmol/L， CaCl2懸浮菌體。近年， Okayama 方案為實(shí)驗(yàn)室普遍采用，該方法可得到全長(zhǎng)的 cDNA。實(shí)際上是利用低等生物如細(xì)菌、病毒、噬菌體等生長(zhǎng)快，繁殖力強(qiáng)的特點(diǎn)，而作為一種核酸擴(kuò)增篩選的載體，把人類等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重組于其中，經(jīng)篩選，克隆得到目的基因與載體重組的重組基因，成為便于保存，取用方便 的基因庫(kù)。 CDNA 通過(guò)各種方式與載體連接，克隆可得到全長(zhǎng) cDNA 或片段，用于探針制備、序列分析、基因表達(dá)等研究。 圖 181 經(jīng)堿性磷酸酶處理后載體 DNA 與目的基因 DNA 的連接 二、目 的 基 因 常把需研究的基因稱為目的基因，需分析的基因稱靶基因，在基因克隆過(guò)程中有時(shí)兩者均稱為插入基因，有時(shí)三者含義相近。 末端轉(zhuǎn)移酶在 Mg2+存在下，選擇 3′－ OH 端單鏈 DNA 為引物加成核苷酸，在 Co2+存在下，選擇 3′－ OH 端雙鏈 DNA 為引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。 Klenow 片段是 DNA 聚合酶 Ⅰ 被枯草桿菌酶作用產(chǎn)生的一個(gè)大片段，有 5′→3′ 聚合酶和 5′→3′ 外切酶活性，無(wú) 3′→5′ 外切酶活性。反應(yīng)需有 Mg2+和 ATP 存在， 。切口分開(kāi)端和粘端，產(chǎn)生 3′－ OH 和 5′－ P 末端。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶等。 常用噬菌體載體有單鏈?zhǔn)删w M13 系統(tǒng)；雙鏈?zhǔn)删w系統(tǒng)。而松弛型由 DNA 多聚酶 Ⅰ 復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞可復(fù)制 3050 個(gè)質(zhì)粒，如果用氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成，使質(zhì)粒有效利用原料，復(fù)制更多的質(zhì)粒。載體具有能自我復(fù)制；有可選擇的，便于篩選、鑒定的遺傳標(biāo)記；有供外源 DNA 插入的位點(diǎn)；本身體積小等特征。利用載體（噬菌體或病毒）把遺傳物質(zhì)從一種宿主傳給另一種宿主的過(guò)程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction）。轉(zhuǎn)化（ transformation）、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)位等是自然界基因重組存在的方式，也是人工基因重組常采用的手段。其中基因工程（基因技術(shù)，基因重組）是目前分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)，這些技術(shù)可以改造或擴(kuò)增基因和基因產(chǎn)物，使微量的研究對(duì)象達(dá)到分析水平，是研究基因調(diào)控和表達(dá)的方法，也是分子水平研究疾病發(fā)生機(jī)制、基因診斷和基因治療的方法。 外來(lái)基因引起細(xì)胞生物性狀改變的過(guò)程叫轉(zhuǎn)化（ transformation），以噬菌體把外源基因?qū)爰?xì)菌的過(guò)程叫轉(zhuǎn)
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