【正文】 HPLC法，除頭孢西丁鈉以苯基鍵合硅膠為填充劑外；其他均以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，反相色譜，紫外檢測。 ? 如：頭孢克洛規(guī)定 : ? 頭孢克洛峰的保留時(shí)間約為 23分鐘，頭孢克洛峰與頭孢克洛 δ 3異構(gòu)體峰的分離度應(yīng)不小于 ，頭孢克洛峰的拖尾因子應(yīng)小于 。 ? 如：頭孢拉定中已知雜質(zhì)： ? 7氨基去乙酰氧基頭孢烷酸（ 7ADCA） ? 雙氫苯苷氨酸（ 220nm） ? 頭孢氨芐 ? 頭孢氨芐中已知雜質(zhì)： ? 7氨基去乙酰氧基頭孢烷酸（ 7ADCA） ? α 苯苷氨酸 ? 頭孢羥氨芐中已知雜質(zhì)： ? 7氨基去乙酰氧基頭孢烷酸（ 7ADCA） ? α 對(duì)羥基苯苷氨酸 ? 頭孢哌酮鈉中已知雜質(zhì)： ? 雜質(zhì) A（原稱為頭孢哌酮降介物 β ） ? 如：頭孢羥氨芐 : ? 供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，含 α 對(duì)羥基苯甘氨酸和 7氨基去乙酰氧基頭孢烷酸按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算， 均不得過 %；其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面（ %），其他各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 3倍（ %） ,供試品溶液色譜圖中任何小于對(duì)照溶液主峰面積 . ? 如：頭孢哌酮鈉 ? 供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，含 雜質(zhì) A按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算， 不得過 %，其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 2倍（ 2％），其他各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 3倍（ %） ,供試品溶液色譜圖中任何小于對(duì)照溶液主峰面積 可忽略不計(jì)。 ? 作為常規(guī)檢驗(yàn)方法有必要進(jìn)行改進(jìn)，考慮到原藥典收載的方法在原理，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以及方法驗(yàn)證專屬性、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性等方面均符合要求，而僅僅是分析周期過長 . ? 因此在研究建立新的方法時(shí)，我們?nèi)圆捎媚z色譜的分離模式，并采用原方法中的自身對(duì)照外標(biāo)法，進(jìn)行高分子聚合物雜質(zhì)的測定。 ? 根據(jù)上面公式，分離度隨著聚合物峰高的增大而增大，故加入藍(lán)色葡聚糖 2022的量應(yīng)該有一定的要求，在研究方法時(shí)，根據(jù)品種項(xiàng)下規(guī)定的限度及藍(lán)色葡聚糖 2022在該系統(tǒng)中的響應(yīng)值 ,－般加入的量為聚合物規(guī)定限度響應(yīng)值的 12倍即可。 % * F值為對(duì)照品溶液濃度 (μ g/ml)與峰面積的比值 表 F值的比較 表 高分子聚合物測定結(jié)果的比較 品種 批號(hào) 2022年版藥典方法 高聚物含量（ %） 改進(jìn)后的方法 高聚物含量（ %） 相對(duì)偏差 阿莫西林囊 0507501 （聯(lián)邦制藥） 均值： % (n=2) 均值： % (n=4) 177。 ? 由于生產(chǎn)工藝的不同，各廠使用的有機(jī)溶媒也不同，同一品種中可能有幾十種的溶媒，為方便操作、經(jīng)試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定各溶劑的相對(duì)調(diào)整保留時(shí)間（ RART）， ? 檢查時(shí)可先做供試品，從供試品中檢出的溶媒的 RART與規(guī)定的 RART比較，確定為何種溶媒時(shí)，再進(jìn)行對(duì)照品測定，可減少工作量，大大降低檢驗(yàn)成本，提高工作效率。分別精密稱取各溶劑適量，用內(nèi)標(biāo)溶液定量稀釋制成規(guī)定濃度的溶液，作為混合對(duì)照品溶液，混合對(duì)照品溶液中各溶劑的濃度分別為每 1ml中含甲醇 600 ug、丙酮 1mg、異丙醇 1mg、乙腈 82ug、二氯甲烷 120ug、丁酮 1mg、乙酸乙酯 1mg，四氫呋喃 150 ug、四氯化碳 1 ug、環(huán)己烷 760 ug、苯 1 ug、 1,2二氯乙烷 1 ug、乙酸異丙酯 1mg、二氧六環(huán) 76 ug、甲基異丁基酮1mg、吡啶 40 ug、甲苯 178 ug。 ? 由于不溶性微粒光阻法測定結(jié)果僅與一定濃度范圍內(nèi)的樣品溶液成正比關(guān)系，因此在標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不溶性微粒檢查供試品溶液濃度。 ? 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，反相色譜，紫外檢測。 ? 如：頭孢地尼 ? 【 含量測定 】 照高效液相色譜法（附錄 Ⅴ D ）測定。 ? 測定法 取本品約 50mg，精密稱定，置 50ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取 20μ l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取氨曲南對(duì)照品適量，同法測定。如圖 。 ? 測定方法 :HPLC，色譜柱 C1檢測波長 232nm ? 紅霉素、乳糖酸紅霉素、硬脂酸紅霉素 ? 紅霉素、乳糖酸紅霉素、硬脂酸紅霉素主要組分均為紅霉素 A、 B、 C . ? 測定方法： HPLC法，色譜柱 C18 , ? 檢測波長 215 nm； ? ? 3個(gè)品種規(guī)定限度相同： ? 紅霉素 A: 以無水物計(jì)不得少于 %，用對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算 . ? 紅霉素 B: 不得大于 5%,用加校正因子（ ）的自身對(duì)照法計(jì)算。 ? 共 25個(gè)制劑，其中 2個(gè)紅霉素腸溶制劑檢查釋放度，其他均檢查溶出度； ? 顆粒劑中包衣顆粒和非包衣顆粒制訂了相應(yīng)的溶出度檢查法（如羅紅霉素顆粒）； ? 混懸顆粒和干混懸劑根據(jù)溶出曲線考察結(jié)果決定是否定入標(biāo)準(zhǔn)。 ? 本類抗生素相對(duì)其他類抗生素而言穩(wěn)定性較好，制劑為注射液品種較多 。 ? 、檢查 ? 供無菌分裝的原料標(biāo)準(zhǔn)正文中增加了 (1)可見異物、 (2) 、不溶性微粒、 (3)無菌。 ? 例 1. 硫酸新霉素 ? 檢查羥苯乙酯 方法為 HPLC（限度： 80%120%） ? 例 2. 妥布霉素滴眼液 ? 檢查羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯扎氯銨， 方法為 HPLC（限度： 80%120% ） ? 、組分 ? 有關(guān)物質(zhì)、組分、特定雜質(zhì)檢查方法修改為HPLCELSD方法的品種較多 ， ? 但有些品種如新霉素、鹽酸大觀霉素仍采用TLC法。 ? 例如： 2022年版藥典中 。 ? 性狀 ? 四環(huán)類抗生素都是結(jié)晶型物質(zhì)，分子內(nèi)含有蒽酮類發(fā)色團(tuán)，一般為黃色結(jié)晶性粉末，干燥的四環(huán)類游離堿和它們的鹽類都比較穩(wěn)定，但在貯存中遇光促使顏色變深，可能有降解物產(chǎn)生。 ? 也可用于四環(huán)類抗生素的分析和鑒定。 ? 2022年版藥典標(biāo)準(zhǔn)中土霉素作為特定雜質(zhì)的單獨(dú)規(guī)定限度，因多批原料及片劑中均未檢出土霉素，故將土霉素作為其他雜質(zhì)控制，另增加對(duì)其他單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)的限度控制。 ? 如：鹽酸四環(huán)素 《 歐洲藥典 》 ： 4差向四環(huán)素 ≤%， 2乙酰 2去酰胺四環(huán)素≤%（該雜質(zhì)在四環(huán)素的峰尾流出），脫水四環(huán)素 ≤%，差向脫水四環(huán)素 ≤%。 ? 鑒別 ? 一般采用 TLC/HPLC、 IR和氯化物反應(yīng)，部分品種增加了紫外鑒別。 ? ? ? 四環(huán)類抗生素在酸性（ ～ ）溶液中，A環(huán)上 4位手性碳原子構(gòu)型易發(fā)生差向異構(gòu)化反應(yīng)，形成差向化合物，四環(huán)素、金霉素、去甲環(huán)素等很容易差向化，形成 4差向異構(gòu)體， ? 土霉素由于 5位上的羥基和 4位上的二甲胺基易形成氫鍵，因而較穩(wěn)定，不易發(fā)生差向異構(gòu)化。 ? 含量測定 有以下五種形式，表 ? （ 1）硫酸卡那霉素，硫酸依替米星及其制劑共 7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的含量測定為 HPLCELSD方法。 ? 2022年版藥典采用的薄層色譜法 (TLC)測定有關(guān)物質(zhì)，屬于半定量方法，只能對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行限度檢查，不能準(zhǔn)確測定樣品中單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)量。（供注射用） ? ? 不溶性微粒 取本品 3g，加微粒檢查用水100ml，制成每 1ml中含 30mg的溶液，依法檢查（附錄 IX C）。 品種收載情況： 表 品種收載情況 原料 制劑 注射液 注射用 滴眼液 口服液 片 緩釋片 顆粒 妥布霉素 √ √* 硫酸小諾霉素 √ √ √ 硫酸巴龍霉素 √ 硫酸卡那霉素 √ √ √ 硫酸西索霉素 √ 硫酸慶大霉素 √ √ √ √ √ 硫酸阿米卡星 √ √ *為新增品種 原料 制劑 注射液 注射用 滴眼液 口服液 片 緩釋片 顆粒 阿米卡星 硫酸奈替米星 √ 硫酸依替米星 √ √ 硫酸核糖霉素 √ 硫酸鏈霉素 √ 硫酸新霉素 √ √ 鹽酸大觀霉素 √ 總計(jì) 14 8 6 4 1 4 1 1 關(guān)鍵檢測項(xiàng)目方法一覽： 表 檢測項(xiàng)目方法 原料 有關(guān)物質(zhì)（包括特定雜質(zhì)） 組分 硫酸鹽 含量測定 TLC HPLCELSD HPLCUV HPLCELSD HPLCUV HPLCELSD 滴定 妥布霉素 √ 微生物（ Ⅰ 、Ⅱ ） 硫酸小諾霉素 √ √ 微生物（ Ⅰ 、Ⅱ ） 硫酸巴龍霉素 √ 無 微生物（ Ⅰ 、Ⅱ ） 硫酸卡那霉素 卡 B √ ELSD 硫酸西索霉素 √ √ 微生物（ Ⅰ 、Ⅱ ） 硫酸慶大霉素 √ √ √ 微生物（ Ⅰ 、Ⅱ ） 硫酸阿米卡星 √ √ HPLCUV 阿米卡星 √ HPLCUV 原料 有關(guān)物質(zhì)（包括特定雜質(zhì)） 組分 硫酸鹽 含量測定 TLC HPLCELSD HPLCUV HPLCELSD HPLCUV HPLCELSD 滴定 硫酸奈替米星 √ √ 微生物（ Ⅰ 、Ⅱ ） 硫酸依替米星 √ √ HPLCELSD 硫酸核糖霉素 √ 微 1 硫酸鏈霉素 √ √ 微生物（ Ⅰ 、Ⅱ ） 硫酸新霉素 新霉胺 √ 微生物（ Ⅰ ） 鹽酸大觀霉素 √ 微生物（ Ⅱ ） ? 修訂情況概要 ? ? 一般采用 TLC法與硫酸鹽反應(yīng)， ? 含量測定或組分采用 HPLCELSD的方法時(shí)，也可用 HPLC作為鑒別， ? 個(gè)別品種也有用 IR作為鑒別反應(yīng)， ? 少數(shù)品種有顯色反應(yīng)鑒別。 ? ? 因制劑中某些輔料與硫酸也會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)，采用硫酸顯色法時(shí) ,采用自身對(duì)照法，以抵消輔料的干擾； ? 同時(shí)多組分品種亦采用自身對(duì)照法，以消除組分比例差異對(duì)結(jié)果的影響。 ? 有關(guān)物質(zhì) ? 除琥乙紅霉素仍采用 TLC法外， 2022年版采用 TLC法的品種均修訂為 HPLC法，共 26個(gè)品種采用 HPLC法； ? 完善了 HPLC系統(tǒng)適用性要求，明確主峰與指定雜質(zhì)的分離度，確保方法的有效性和準(zhǔn)確性； ? ? 增加特定雜質(zhì)的控制（如阿奇霉素）和總雜的控制（如羅紅霉素）； ? 首次對(duì)紅霉素及其衍生物有關(guān)物質(zhì)檢測方法進(jìn)行了統(tǒng)一。具體見 表 。 ? 標(biāo)準(zhǔn)中涉及的已知雜質(zhì)，在標(biāo)準(zhǔn)最后列出其化學(xué)命名，便于與國外藥典標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)比較。 取頭孢地尼對(duì)照品約 20mg，置 100ml量瓶中，加上述，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，在水浴中加熱不少于 30分鐘，放冷，得每 1ml中約含 合溶液（其中相對(duì)主峰保留時(shí)間 的量各約為 2%）， ? 取 20μ l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，頭孢地尼峰保留時(shí)間約為 8分鐘， E異構(gòu)體峰保留時(shí)間約為頭孢地尼峰保留時(shí)間的 ，理論板數(shù)按頭孢地尼峰計(jì)算不低于 2022，頭孢地尼峰與其相對(duì)保留時(shí)間 度均應(yīng)不小于 。利用該類藥物遇光照或加熱能產(chǎn)生反式異構(gòu)體或 E異構(gòu)體等有關(guān)物質(zhì)?？紤]臨床使用的安全性，在標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定： ? 規(guī)格 ，每 1g樣品中，含 10181。 ? 測定法 首先取甲烷氣體頂空進(jìn)樣，記錄甲烷的保留時(shí)間作為色譜系統(tǒng)的死時(shí)間（ t0）再取供試品溶液頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖中如有色譜峰，按下式計(jì)算各色譜峰的保留時(shí)間（ tR）相對(duì)于正丙醇保留時(shí)間（ tR（正丙醇））的相對(duì)調(diào)整保留時(shí)間（ RART）； 0)(0 tt ttRARTRR －正丙醇??0)(0ttttR A R TRR－正丙醇??? 將得到的 RART值與下表的 RART值比較，確定供試品中的殘留溶劑種類；再制備相應(yīng)的對(duì)照品溶液，取對(duì)照品溶液頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比值計(jì)算，甲基異丁基酮不得過 %；、其他均應(yīng)符合規(guī)定。 ? 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以 6%氰丙基苯基 94%二甲基聚硅氧烷為固定液（或極性相近）的毛細(xì)管柱為色譜柱，柱溫 40℃