蛋白質(zhì)iippt課件(已修改)
2025-05-14 08:56 本頁(yè)面
【正文】 蛋白質(zhì)（ II） —— 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu) ? 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（ Primary structure） ? 定義：蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)，即蛋白質(zhì)分子內(nèi)部通過(guò)共價(jià)鍵連接而形成的結(jié)構(gòu)形式 ? 氨基酸在蛋白質(zhì)內(nèi)的排列順序 ? 二硫鍵的位置和連接順序 ? 側(cè)鏈基團(tuán)的修飾和連接情況 ? 是否磷酸化，磷酸化位置 ? 是否糖基化，糖基化位置，糖鏈組成 ? 是否酯化，酯化位置，酯的組成 ? 是否有輔基或其他分子 ,連接方式 ? 肽 鍵 ? 蛋白質(zhì)是氨基酸通過(guò)脫水縮合形成肽鍵而形成的 ? 實(shí)驗(yàn)證據(jù) （ 1）蛋白質(zhì)分子中游離的 α氨基， α羧基很少。若水解，游離 α氨基， α 羧基以等 mol數(shù)增加 →說(shuō)明 α氨基， α羧基參與某種結(jié)合，水解時(shí)，這種結(jié)合斷開。 （ 2） 人工合成肽可以被蛋白酶水解 O ‖ （ 3） 包含 CN H基團(tuán)的化合物如雙縮脲 H2NCONHNH2能與硫酸銅 氫氧化鈉溶液產(chǎn)生雙縮脲顏色反應(yīng)。天然蛋白質(zhì)也存同樣反應(yīng)。 （ 4）人工合成的多聚 AA的 X射線衍射圖案和紅外吸收光譜與天然的纖維狀蛋白質(zhì)十分相似。 （ 5）我國(guó)在世界上首次人工合成蛋白質(zhì) 結(jié)晶牛胰島素的成功，完全證明了蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)學(xué)說(shuō)的正確性。 ? 肽鍵的特點(diǎn) ? 酰胺鍵： 由于酰胺氮上的孤對(duì)電子與相鄰羰基的共振作用，表現(xiàn)出高穩(wěn)定性 ? C－ N具 40％雙鍵性質(zhì) ? C＝ O具 40％單鍵性質(zhì) ? 共振雜化體 ? 亞氨基（－ NH－） pH 0－ 14沒(méi)有明顯的解離和質(zhì)子化傾向 ? 肽鍵是一個(gè)平面，稱肽平面?？梢杂蟹词巾樖浇Y(jié)構(gòu)，但旋轉(zhuǎn)能障較高，反式穩(wěn)定（ Pro例外） ? 蛋白質(zhì)中的每一個(gè)氨基酸單位稱氨基酸殘基（ residue） ? 肽鏈結(jié)構(gòu)的命名與書寫 ? 根據(jù)含 Aa的數(shù)目命名： **肽 ? 從 NH2末端 Aa殘基開始，稱為：某氨基酰某氨基酰某氨基酰 ….. 氨基酸 ? 書寫時(shí)氨基端在左邊，羧基端在右邊；以氨基酸的三字縮寫或單字縮寫代表對(duì)應(yīng)的氨基酸；用短橫線代表氨基酸殘基之間的肽鍵 肽的物理化學(xué)性質(zhì) ? 一般物理性質(zhì) ? 短肽晶體、熔點(diǎn)很高（離子晶體、偶極離子） ? 肽的兩性解離 ? 決定于游離氨基末端、游離羧基末端以及側(cè)鏈基團(tuán) ? 肽鏈羧基的 pK’比氨基酸的大一些，而氨基的 pK’則要小一些 ? 多肽等電點(diǎn)的計(jì)算 ? 中性肽的等電點(diǎn) ? 酸性肽的等電點(diǎn) ? 堿性肽的等電點(diǎn) ? 常見化學(xué)反應(yīng) ? N端氨基酸殘基與茚三酮、 DNFB、 PITC等反應(yīng) ? C氨基酸殘基成酯、成酰胺、成鹽 ? 側(cè)鏈氨基酸的反應(yīng) ? 磷酸化： Tyr、 Ser、 Thr ? 酯化： Ser、 Thr、 Tyr ? 糖基化： Ser、 Thr、 Cys ? 雙縮脲反應(yīng)（ Biuret reaction）： ? 多肽與 CuSO4堿性溶液反應(yīng)，生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物， 540nm處有最大光吸收。 ? 為肽和蛋白質(zhì)特有（兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵），氨基酸沒(méi)有該反應(yīng)。 天然活性多肽 ? 定義： ? 在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位，但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽 ? 常見活性多肽 ? 谷胱甘肽（ GSH） ? ?GluCysGly ? 巰基緩沖劑 ? 腦啡肽（ enkephalins） ? 神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的一類短肽，具有多種特殊生物學(xué)功能。 ? 蕈毒素、蛇毒素 ? ?－鵝膏蕈堿 ： 能與真核生物的 RNA聚合酶（ RNA polymerase） Ⅱ 和 Ⅲ 牢固結(jié)合而抑制酶的活性，因而使 RNA的合成不能進(jìn)行，但不影響原核生物的 RNA合成。 ? 短肽類抗生素 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 ? 氨基酸順序測(cè)定的一般步驟 ? 要求： ? 樣品均一 ? 純度 97%以上 ? 已知分子量 （誤差小于 10%） ? 一般步驟： ? 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 ? 蛋白質(zhì)末端殘基（ NH2末端、 COOH末端） mol數(shù) ? 蛋白質(zhì)的分子量 ? 拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈 ? 測(cè)定多肽鏈的 Aa組成 ? 分析多肽鏈的 N末端和 C末端殘基 ? 斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵 ? 過(guò)甲酸氧化 ? 巰基化合物還原 ? 多肽鏈斷裂成肽段 ? 酶解法 ? 化學(xué)法 ? 測(cè)定各個(gè)肽段的 Aa順序 ? Edman降解法 ? 確定肽段在多肽鏈中的次序 ? 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置 ? 多肽 N末端分析方法 ? 二硝基氟苯（ DNFB or FDNB法）， Sange試劑 ? 丹磺酰氯（ DNS）法 ? 原理：與 DNFB相同 ? 優(yōu)點(diǎn)： DNS具強(qiáng)烈的熒光， 檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到 1?109mol比 DNFB法高 100倍 ? 苯異硫氰酸酯（ PITC）法 ? 氨肽酶法 ： ? 氨肽酶： 可以從多肽鏈的 N端 逐個(gè) 降解氨基酸的 肽鏈外切 酶 ? 亮氨酸氨肽酶（ LAP） ：水解以 Leu為 N末端的肽鍵速度為最大 ? 多肽 C末端分析方法 ? 肼解法 ? 蛋白質(zhì) or 多肽＋無(wú)水肼 , C末端 Aa以游離形式存在，其他Aa轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的 Aa酰肼化物加入苯甲醛可以使 Aa酰肼化物轉(zhuǎn)變成二苯基衍生物沉淀， C末端 Aa則在溶液中。 ? 缺點(diǎn)： Gln、 Asp、 Cys破壞不易測(cè)出， Arg → Orn ? 還原法： ? 肽鏈 C末端 Aa + 硼氫化鋰 ? ?－氨基醇 ? 羧肽酶法 ? 最有效，最常用的測(cè) C端殘基方法 ? 羧肽酶：專一地從肽鏈的 C端逐個(gè)降解，釋放出游離 Aa肽鏈外切酶 ? 多肽鏈的部分?jǐn)嗔押碗亩蔚钠唇? ? 常用蛋白酶（內(nèi)切酶） ? 胰蛋白酶 （ Trypsin ） ： ? 專一性強(qiáng)、只斷裂 Lys、 Arg的羧基參與形成的肽鍵 ? 可以通過(guò)修飾增加或減少酶切位點(diǎn) ? 糜蛋白酶（ Chymotrypsin ） ? 專一性 ﹤ 胰蛋白酶 ， 斷裂 Phe, Trp, Tyr等疏水芳香 Aa的羧基所形成的肽鍵 ? 斷裂鍵鄰近的基團(tuán)若為堿性：裂解能力 ↑，酸性：裂解能力 ↓ ? 嗜熱菌蛋白酶（ thermolysin ） ? 含 Zn. Ca， Zn是 活力必需的， Ca與 熱穩(wěn)定有關(guān) ? 專一性差，斷裂較短的多肽鏈 or大肽段 最適 PH8－ 9 ? 胃蛋白酶（ Pepsin） ? 專一性 ＝ 糜蛋白酶 ，要求被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性 Aa ? 最適 PH2，可用來(lái)確定二硫鍵的位置
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