蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析ppt課件(已修改)
2025-05-17 18:58 本頁面
【正文】 第二章 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 第一節(jié) 蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)樣品，一般要求純度 95％。這樣的樣品，通 常是用色譜和電泳精制過的。 一、 SDS— PAGE純化的樣品 從 SDSPAGE上分離的蛋白質(zhì)必需經(jīng)過特殊處理，使 SDS濃度低于 ％，否則 SDS會影響到胰蛋白酶的酶解，也會大大降低 HPLC分肽 時的分辨率。有報道指出，在 2mol／ L尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白 質(zhì)時，如果 SDS濃度 ％，則完全阻止了胰蛋白酶和內(nèi)肽酶 LysC的 作用。 雖然有報道用 HPLC或用鹽酸胍沉淀除去 SDS，但不易掌握，尤其是共 價結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的 SDS分子更難除去。 在 SDSPAGE后，采用電印跡 (blotting)到 PVDF膜上，也是常用的方 法，因為 PVDF膜結(jié)合蛋白質(zhì)能力的專一性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其結(jié)合鹽、氨基酸和 去垢劑，因此，蛋白質(zhì)能和這些 “ 污染物 ” 分開。經(jīng)過這樣處理后，能用于 BrCN化學(xué)裂解或酶解。 二、 HPLC純化的樣品 如果樣品是用反相 HPLC純化的，因為流動相是揮發(fā)性溶劑，它們在 真空離心干燥或凍干樣品時除去；如果蛋白質(zhì)是用離子交換 HPLC或疏水 HPLC或凝膠過濾 HPLC精制的，則樣品要進(jìn)行脫鹽。 脫鹽或稀蛋白溶液的濃縮可用 ％三氟乙酸 (TFA)— 乙腈 (ACN)系統(tǒng) 的短柱反相 HPLC；也可采用一次性的 SekPak，因為蛋白質(zhì)是水溶性 的，所以先用能與水互溶的甲醇或乙腈 (2ml)潤之，再用 5ml純水洗 滌；然后樣品液體通過 SepPak柱時，蛋白質(zhì)保留在柱上，小分子的鹽 類流過柱體，用水溶液充分洗滌后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白質(zhì)。 小的超濾裝置對濃縮蛋白質(zhì)也是有效的。此外，有機溶劑或 TCA沉淀 也可以考慮。 三、蛋白質(zhì)樣品中的二硫鍵和巰基 (一 SH) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品純度達(dá)到要求，鹽和小分子也除得比較 “ 干凈 ” ，在進(jìn)行 酶解前，還要轉(zhuǎn)變半胱氨酸殘基成其他的穩(wěn)定的衍生物。因為半胱氨酸 的巰基在分肽過程中易自動氧化成各種產(chǎn)物，包括形成無序的二硫鍵， 因此需要將半胱氨酸殘基先轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的衍生物。 常用有碘代乙酸烷化，因為這個反應(yīng)是快速和專一的；同時這類試劑 保存在暗處是很穩(wěn)定的。而且，這類試劑的矯作物 (artifact)容易得到放 射性標(biāo)記物。蛋白質(zhì)或肽在導(dǎo)入帶電荷基團后也增加了其在水溶液中的 溶解度。胱氨酸也可在還原后再修飾。 1．還原和羧甲基化 將 1 ～ 20mg蛋白質(zhì)溶解在含 6mol/L鹽酸胍的 1mmol/LEDTA的緩沖液中， ，加 DTT至 2mmol/L或再多一些 (過量于存在于蛋白質(zhì)中的二硫鍵 )，通氮氣，然后迅速封閉， 37℃ 反應(yīng) 1h，再加入 50mmol/L的碘代乙酸 (已用 NaOH中和 )，其量為 (分 子比 )過量于溶液中的巰基數(shù) (蛋白質(zhì)中的一 SH和 DTT中的一 SH總和 ),典 型為 ～ 5mmol/L，再次充氮氣，于暗處 37℃ 保溫 1h。加 2— 巰基乙 醇至最后濃度 1％ (V/V)結(jié)束反應(yīng)，然后對 50mmol/LNH4HC03，含 ％硫二甘醇 (thiodiglyc01)充分透析，凍干。 注意：碘代乙酸必須是無色的，如果有碘存在，呈淡黃色，會引起巰 基迅速氧化，阻礙了烷化反應(yīng)，而且可能有副反應(yīng)，使色氨酸修飾。 碘代乙酰胺 (iodoacetamide)也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸殘基的 烷化。這常用于避免牛胱氨酸被導(dǎo)入負(fù)電荷，而用中性的碘代乙酰胺。 另一種情況是變性劑不用鹽酸胍，而用 SDS，這時如果用碘代乙酸，反 應(yīng)往往進(jìn)行得很慢，而且不完全，這是因為碘代乙酸的負(fù)電荷和蛋白 質(zhì) — SDS膠束 (微團 )上的負(fù)電荷相互排斥。 2．還原和吡啶乙烯化 用 4— 乙烯吡啶 (4vinylpyridine)處理同上，通氮氣保溫過夜。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)的化學(xué)裂解 裂解于甲硫氨酸 (Met) 溴化氰 (BrCN)是首選的化學(xué)試劑，專一裂解在甲硫氨酸的羧 基端，對多數(shù)蛋白質(zhì)裂解效率為 90％以上。 BrCN在酸性條件下， 裂解在甲硫氨酸的 C端肽鍵上，將甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成高絲氨酸 (Ⅱ )(homoserine)和高絲氨酸內(nèi)酯 (I)(homoserinelactone)的混合物， 它們之間也能相互轉(zhuǎn)化，如圖 。 對 MetThr、 MetSer鍵，則常常是低產(chǎn)率的，可能是 β羥基產(chǎn)生下 面的一系列反應(yīng) (Ⅲ 和 Ⅳ )，最后形成高絲氨酸殘基 (V)，而未裂解此肽 鍵，如圖 。 MetCys鍵也不易裂解。 典型的反應(yīng)常常在 20℃ 、 70％甲酸 (V/V)中進(jìn)行 24h， 副反應(yīng)是部分 AspPro
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