聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用-文庫(kù)吧
2025-05-11 18:12 本頁(yè)面
【正文】 Tth DNA聚合酶（ Thermus thermophilus） 好地克服 RNA鏈中普遍存在二級(jí)結(jié)構(gòu)的難題。 Tth DNA聚合酶在較高的溫度下仍具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，因此 能很 用于 PCR的 DNA聚合酶簡(jiǎn)介 Pfu是一種 高保真 的 DNA聚合酶，出錯(cuò)率極低； Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增出的產(chǎn)物帶有平頭末端； Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增速度極快，達(dá) 2 min / kb； Pfu DNA聚合酶（ Pyrococcus furiosus） Pfu DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性很高。 X 10–7 X 10–6 用于 PCR的 DNA聚合酶簡(jiǎn)介 Vent DNA聚合酶具有 3’ →5 ’ 的核酸外切酶活性和校正功能，因此 與其它 DNA聚合酶（如 Taq酶 ）相比，具有相對(duì)較好的高保真性，其 出錯(cuò)率為 X 10–5 X 10–5 ； Vent DNA聚合酶（ Thermococcus litoralis） 度小于 2 kb時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度與 Mg2+的濃度并無(wú)關(guān)聯(lián)； 如果擴(kuò)增長(zhǎng)度大于 2 kb， 則需要高于 2 mM的 Mg2+， 而在擴(kuò)增長(zhǎng) 如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷， Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。 用于 PCR的 DNA聚合酶簡(jiǎn)介 DeepVent DNA聚合酶是一種在低溫和高溫條件下均極其穩(wěn)定的 聚合酶，且能使用廣范圍的輔助溶劑如甲酰胺和 DMSO等； DeepVent DNA聚合酶能產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá) 14 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，其 外切酶 DeepVent DNA聚合酶（ Pyrococcus species GBD） 活性 比 Vent DNA聚合酶高 4 倍，聚合活性比 Taq DNA酶高 515倍， 度小于 2 kb時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度與 Mg2+的濃度并無(wú)關(guān)聯(lián)； 如果擴(kuò)增長(zhǎng)度大于 2 kb， 則需要高于 2 mM的 Mg2+， 而在擴(kuò)增長(zhǎng) 如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷， Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。 出錯(cuò)率 比 Vent DNA聚合酶低 2 倍； 用于 PCR的 DNA聚合酶簡(jiǎn)介 UlTma是一種高保真的 DNA聚合酶，可以較高的產(chǎn)量擴(kuò)增小于 3 kb的 DNA靶序列，產(chǎn)物呈平頭末端。 UITma DNA聚合酶（ Thermotoga maritima） DNA聚合酶的使用 DNA聚合酶的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 1 5 Units / mL 特異性的改進(jìn)： 在建議使用的范圍內(nèi)盡可能地降低酶濃度。 聚合酶的濃度是決定 PCR反應(yīng)成本的 的重要參數(shù)，濃度 過(guò)高不僅能降特異性，同時(shí)也導(dǎo)致不必要的消耗。 準(zhǔn)確性的改進(jìn)： 建議使用高保真的 DNA聚合酶 PCR模板制備與純化 3 PCR的模板與制備 PCR模板的使用 粗樣品中的 PCR抑制劑 PCR模板制備與純化 DNA和 RNA均可作為 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，但一般情況下， mRNA 先逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。 PCR模板的來(lái)源主要有兩大類： 純凈物 如重組質(zhì)粒、制備的染色體 DNA、 回收的 DNA片段 粗樣品 如糞便、腦脊髓液、血液、食物、動(dòng)物貝殼、土壤、 尿液、唾液、福爾馬林固定劑、組織切片、膿汁、噴 嚏液、痰液等 上述粗樣品 含有大量的 PCR反應(yīng)抑制物質(zhì)，因此如何 去除 這些種類 繁多的 抑制劑 或者 添加 必要的 PCR反應(yīng) 增強(qiáng)劑 顯得十分重要。 PCR模板制備與純化 從各種粗樣品中去除 PCR反應(yīng)抑制劑的程序不盡相同，但常用的 手段包括： 樣品稀釋 溶劑萃?。?氯仿 ﹕ 異戊基乙醇 49﹕1 ） 乙醇沉淀 高速離心 超濾 粗樣品中的 PCR抑制劑 糞便 膽鹽、膽紅素（抑制濃度 50mg / mL） 血液 亞鐵血紅素、聚乙醇磺酸鈉、 heparin（ 抗凝劑） 土壤 腐殖物質(zhì)、含鐵化合物 植物 硫酸右旋糖苷 食品 未鑒定的抑制劑 痰液 未鑒定的抑制劑 PCR模板的使用 PCR模板 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 102 105 拷貝 特異性的改進(jìn)： 增加模板 DNA的量、降低引物與模板的分子比 有效性的改進(jìn)： 增加引物與模板的分子比 模板濃度的變化很大程度上取決于待擴(kuò)增的堿基序列，但一般 而言，模板 DNA長(zhǎng)度小， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量就大，因此對(duì)于大分子 量的模板 DNA（ 尤其是真核生物基因組 DNA）， 在擴(kuò)增之前最好先 用超聲波處理或限制性酶消化 。 PCR引物的設(shè)計(jì)原則 4 PCR的引物設(shè)計(jì)及合成 PCR引物的使用 引物的在線設(shè)計(jì)工具及免費(fèi)軟件簡(jiǎn)介 PCR引物的設(shè)計(jì)原則 選擇合適的引物是 PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要步驟，合適引物最基本的 引物的長(zhǎng)度 標(biāo)準(zhǔn)就是與靶序列的 高特異性雜交 。為達(dá)到此目的，引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意 下列幾點(diǎn)： 理想的引物長(zhǎng)度應(yīng)該在 1830個(gè)堿基之間，常見(jiàn)的是 2027個(gè)堿基 PCR引物的設(shè)計(jì)原則 引物的 GC含量 引物序列中的 GC含量應(yīng)在 35% 65%之間，最好在 45% 55%范 圍內(nèi)。如果因靶序列的原因，引物不得不含有 過(guò)高 的 GC堿基，那么就 在其 5’ 端設(shè)計(jì)一串 A或 T； 同樣，如果引物中的 AT含量過(guò)高，就在其 5’ 端設(shè)計(jì)一串 G或 C， 以便將整條引物的 GC含量控制在合適的范圍內(nèi)。 PCR引物的設(shè)計(jì)原則 退火
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