【正文】 ............................ 34 實(shí)驗(yàn)儀器 .................................................................................................................. 34 實(shí)驗(yàn)原理 .................................................................................................................. 35 實(shí)驗(yàn)步驟 .................................................................................................................. 35 結(jié)果與討論 ........................................................................................................................ 36 粒徑分布 ......................................................................................................................... 36 TEM 分析與 EDX 分析 ............................................................................................. 36 載藥率與包封率 ....................................................................................................... 37 細(xì)胞存活率 .............................................................................................................. 37 本章小結(jié) ............................................................................................................................ 38 第五章 總結(jié)與展望 ........................................................................................................................ 39 總結(jié) ................................................................................................................................... 39 展望 ................................................................................................................................... 39 致 謝 ............................................................................................................................................. 40 參考文獻(xiàn) ....................................................................................................................................... 41 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 1 第一章 緒論 硒 化學(xué) 的研究進(jìn)展 硒是機(jī)體生命活動(dòng)不可缺少的一種微量元素，被稱 為 ―生命奇效元素 ‖[1]。但由于毒性，硒曾被認(rèn)為是一種對(duì)高級(jí)生物有害的元素。 1973 年， Rotruck 等人發(fā)現(xiàn)硒是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 GSHPx 的活性成分后 [3]，已經(jīng)陸續(xù)有 25 種含硒蛋白被發(fā)現(xiàn)。此后，硒與硒化合物的生理作用受到普遍關(guān)注。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，硒與人類 40 種疾病有關(guān)，如大骨節(jié)病、克山病、白內(nèi)障、癌癥等。微量元素硒具有防癌，抗癌，抗氧化，拮抗重金屬，抗逆境 等多種生物學(xué)活性 [8] 。近年來(lái)，硒與硒化合物的抗腫瘤活性受到普遍關(guān)注，人們一直致力于設(shè)計(jì)和改造含硒化合物，以尋找抗腫瘤活性強(qiáng)，抗腫瘤譜廣，毒副作用低，適用于臨床的含硒抗腫瘤藥物 [1]。無(wú)機(jī)硒主要包括硒，硒酸鹽 (亞硒酸鈉 ,亞硒酸鋅等 )，氧化硒，硫化硒，氯化硒以及硒化物（硒化氫，硒化鈉，硒化鉀等）等。硒在生物體內(nèi) 主要以有機(jī)硒化合物的形式存在，一類是含硒氨基酸，另一類是含硒蛋白質(zhì)。而相比之下，有機(jī)硒化合物吸收率高，生物活性強(qiáng)，毒性低和環(huán)境污染小，不僅能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在激發(fā)免疫反應(yīng)上也比無(wú)機(jī)硒顯著，抗癌作用更強(qiáng) [11]。從此有機(jī)硒化合物的研究引起了廣泛關(guān)注， Shahd 等人在 20xx 年報(bào)道了有機(jī)硒化合物 Methylseleninic acid (MSA)和它莫西芬一起可以治療子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌 [13]。在哺乳動(dòng)物組中，硒代氨基酸是硒的主要存在形式，包括硒代胱氨酸 (SeCys) 和硒代蛋氨酸 (SeMet)。結(jié)構(gòu)式如圖 。 Chen等 [15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較幾種含硒化合物對(duì)八種人類癌癥細(xì)胞的抗癌活性，實(shí)驗(yàn)證明， SeC 與亞硒酸鹽對(duì) A375， MCF7， HepG2， SW620 等癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性比硒代蛋氨酸，硒甲基硒氨酸，硒酸鹽等強(qiáng)。因此， SeC 具有更廣譜高效的抗腫瘤活性，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。 雖然 SeC 作為抗腫瘤藥物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但是從 Chen 等 [16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SeC 的水溶性與穩(wěn)定性較差， 進(jìn)入 MCF7 細(xì)胞發(fā)揮作用的時(shí)間比較長(zhǎng)， 36 h 之后才觀察到明顯的細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，且 72 h 后的 IC50=177。 因此，希望借助納米藥物載體來(lái)提高細(xì)胞吸收，減少它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的時(shí)間。1990 年 7 月，在美國(guó)巴爾的摩召開(kāi)了第一界國(guó)際納米科技會(huì)議，標(biāo)志著納米科技的正式誕生。所謂納米技術(shù)則是指 nm 內(nèi)的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)的構(gòu)造技術(shù)，即納米級(jí)材料的設(shè)計(jì)，制造，測(cè)量和控制技術(shù) [17]。當(dāng)物體達(dá)到納米級(jí)后，納米粒子在熱學(xué)、光學(xué)、磁學(xué)力學(xué)及電化學(xué)方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì) [18]。納米技術(shù)與材料已經(jīng)在航天，汽車，消費(fèi)日用品，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得應(yīng)用，并取得一些列舉世矚目的成果 [19]。納米技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在一下幾個(gè)方面：控釋載藥微粒，靶向載藥微粒，磁導(dǎo)航靶向載藥微粒，基因載體 [20]。 納米藥物載體的研究進(jìn)展 理想的納米粒載體應(yīng)是無(wú)毒和可生物 的。雖然，納米藥物載體作為載藥系統(tǒng)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些問(wèn)題，如生物相容性以及細(xì)胞毒性等。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 4 圖 納米藥物載體的類型 目前，用于納米藥物載體研究的生物可降解聚合物主要有合成聚合物和天然高分子聚合物。天然高分子聚合物主要包括天然多糖，多肽以及其他親水性生物可降解聚合物 [23]。近年來(lái)，生物大分子材料由于其可再生性，無(wú)毒性以及良好的生物相容性，生物可降解性和黏膜粘附性等優(yōu)點(diǎn)成為藥物載體研究的熱點(diǎn)，于是利用生物大分子材料來(lái)制備納米藥物載體的研究應(yīng)運(yùn)而生。蛋白質(zhì)一般包括如明膠，白蛋白，絲蛋白等物質(zhì)，多糖類一般包括如殼聚糖，海藻酸 鈉，環(huán)糊精，果膠等物質(zhì)。 殼聚糖 納米粒子 在納米藥物載體領(lǐng)域的制備和應(yīng)用 殼聚糖的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 殼聚糖也稱為甲殼胺或幾丁聚糖殼聚糖，是一種天然的生物高分子線性多氨基多糖，為甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物。殼聚糖的化學(xué)名稱為 (14)2氨基 2 脫氧 D葡聚糖，甲殼素的化學(xué)名稱為 (14)2乙酰胺基 2 脫氧 D葡聚糖 [27]。 圖 殼聚糖與甲殼素的結(jié)構(gòu) (A) 甲殼素 (B)殼聚糖 殼聚糖的每個(gè) C6 單元均含有一個(gè)氨基，兩個(gè)自由羥基。它不溶于水和有機(jī)溶劑，但是能溶于 PH 的乙酸（ 13 %）溶液中 [28]。曹等 [30]通過(guò)研究表明，殼聚糖無(wú)細(xì)胞毒性，不溶血，不致敏，生物相容性良好，可以滿足醫(yī)藥衛(wèi)生及化妝品原料的基本要求。其中，殼聚糖 納米粒子 載藥體系比其他體系更具優(yōu)勢(shì)。近幾年殼聚糖 納米粒子 的 制備和應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn) [31]。 (1)乳化交聯(lián)法 乳化交聯(lián)法是制備殼聚糖 納米粒子 的常用方法之一。其反應(yīng)機(jī)理如圖 。操作流程如圖 。 圖 殼聚糖交聯(lián)反應(yīng)方程式 C h i t os a n a qu e ou s s ol u t i onO il ph a s eE m u ls if ic a ti on ( W /O) e m u ls io nHa r de n in g of dr ople tsS e pa r a ti on of pa r ti c le sS ti r or U lt r a s ou n dC r os s li n kin ga g e n t 圖 乳化交聯(lián)法操作流程 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 7 采用乳化交聯(lián)法，可以通過(guò)控制含水液滴的大小來(lái)控制 納米粒子 的粒徑，最終產(chǎn)物納米粒子 的粒徑也取決于在形成乳液時(shí)的油相比，交聯(lián)程度等。其操作流程如圖 。 納米粒子 的粒徑取決于噴嘴的直徑，噴嘴流率，霧化壓力，入口溫度和交聯(lián)程度等因素 [32]。 圖 噴霧干燥法操作流程 (3)逐層自組裝 逐層自組裝法適用于制備球壁厚度可控的空心 納米粒子 。通過(guò)限制溶質(zhì)沉降次數(shù)可控制空心 納米粒子 的球殼厚度，除去 納米粒子 中的核物質(zhì)即可獲得所需的空心結(jié)構(gòu)。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 8 圖 逐層自組裝反應(yīng)流程 (4)界面聚合法 界面聚合法是將含有親水性單體溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有機(jī)溶劑中，然后加入溶于該有機(jī)溶劑的疏水性單體（多元酰氯，多元硫酰氯，多異氰酸酯等），使兩種單體在水 /油界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)形成聚合物球殼。先將殼聚糖與 α氨基NCA（ Ncarboxyanhydride）接枝共聚，再將一定量 L亮氨酸 NCA 分散至乙酸乙酯中，并用 Span80 乳化后與水溶性殼聚糖在一定條件下反應(yīng) 2 h，經(jīng)進(jìn)一步處理可得殼聚糖空心納米粒子 [32]。制備的方法是將用高壓空氣將殼聚糖溶液吹入堿性溶液如氫氧化鈉，氫氧化鈉甲醇溶液或乙二胺溶液中，沉降形成 納米粒子 ，如圖 所示。另一種操作方法為：在殼聚糖溶液中加入表面活性劑，然后再逐滴加入硫酸鈉溶液，攪拌或超聲 30 分鐘后，離心分離出產(chǎn)物。 圖 沉淀法反應(yīng)示意圖 (6)其他制備方法 制備殼聚糖 納米粒子 的方法還有很多。目前最常用的方法是將殼聚糖醋酸溶液加入含表面活性劑的液體石蠟中，形成 W/O 型乳劑，升溫再減壓干燥除去溶劑，分離得到殼聚糖 納米粒子 。常見(jiàn)的殼聚糖 納米粒子 制備方法還有離子凝膠法，反膠束法，殼聚糖包裹法和殼聚糖 納米粒子 乙?；ǖ?[33]。它的應(yīng)用主要有以下幾方面： (1)作為藥物載體，可包埋多種類型藥物 殼聚糖 納米粒子 由于其良好的生物相容性，生物降解性和低細(xì)胞毒性，被廣泛應(yīng)用于藥物載體方面。 Hejazi 等采用乳化交聯(lián)法制備了包載四環(huán)素的殼聚糖 納米粒子 。 Jaganathan 等 [37]采用乳化交聯(lián)法制備了載有破傷風(fēng)類毒素的殼聚糖 納米粒子 ，穩(wěn)定劑海藻糖能夠保持抗原蛋白質(zhì)的活性， 納米粒子 的包封率也從加入海藻糖前的 40%提高到 90%。 Wang 等制備了殼聚糖胰島素 納米粒子 ，其包封率高達(dá) 70%，胰島素的化學(xué)穩(wěn)定性大于 95%，并且胰島素可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定釋放。 (3)增加藥物的靶向性 殼聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通過(guò)控制殼聚糖 納米粒子 的大小，形狀，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法，能夠提高殼聚糖 納米粒子 的靶向效果。 (4)降低藥物的毒副作用，提高療效 載有藥物的殼聚糖 納米粒子 循血液循環(huán)到達(dá)靶區(qū)周圍釋放藥物，使靶區(qū)周圍很快達(dá)到有效的治療藥物濃度，而在機(jī)體其他部位藥物的分布量較小，從而減少了對(duì)機(jī)體正常組織的毒副作用，同時(shí)由于載體殼聚糖本身具有一定的生理活性，且無(wú)毒，與藥物可產(chǎn)生協(xié)同作用增強(qiáng)療效。 (5)提高疏水性藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性，增 強(qiáng)細(xì)胞吸收 殼聚糖 納米粒子 溶脹引起的擴(kuò)散釋藥過(guò)程可以增加藥物在吸收部位的濃度梯度，對(duì)藥物的吸收具有協(xié)同促進(jìn)作用。 Mooren 等研究了潑尼松龍磷酸鈉殼聚糖 納米粒子 通過(guò)上皮細(xì)胞膜的情況，結(jié)果表明，殼聚糖 納米粒子可以改善上皮細(xì)胞膜對(duì)疏水性藥物通透性。 (6)提