【正文】 受人們喜愛(ài)。普洱茶通過(guò)其獨(dú)特的生產(chǎn)方式 — 渥堆發(fā)酵以及在貯藏陳化過(guò)程中，曬青毛茶原料中豐富的多酚類、糖類、蛋白質(zhì)等多種化合物在多種好氧和厭氧微生物以及水熱作用下發(fā)生一系列轉(zhuǎn)化。茶葉中的色素化合物有存在于茶鮮葉中的天然色素以及加工過(guò)程中形成的色素，這些色素是茶葉色澤、湯色及葉底色澤的基礎(chǔ) [12]。 Lin, 由基能力和抑制氧化氮自由基 (nitric oxide radicals)生成的能力 [3]。揭國(guó)良等研究表明普洱茶水提物中的乙酸乙酯 萃取層組分和正丁醇萃取層組分對(duì) DPPH和羥自由基均有較強(qiáng)的清除能力 [5]。 普洱茶屬后 發(fā)酵茶，綠茶屬不發(fā)酵茶。 大量 的 研究報(bào)道證實(shí)綠茶中的多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化 活性 .盡管普洱茶中多酚的含量比綠茶類少，但用超濾分離法得到的普洱水 提物經(jīng)分析后得出高分子量物質(zhì)(MW300oDaltons)多于 50%(w/W)，且普洱 茶中沒(méi)食子酸的含量高于綠茶 [67]。 開(kāi)發(fā)和研制天然植物抗氧化劑，消除氧自由基對(duì)機(jī)體的損害作用，是目前醫(yī)藥和食品研究中的一個(gè)重點(diǎn)。 本試驗(yàn)內(nèi)容：提取云南普洱茶及曬青毛茶不同溶劑提取物；制備不同濃度梯度的提取物待測(cè)樣；根據(jù)試驗(yàn)條件選擇合適的清除自由基評(píng)價(jià)方法，明確評(píng)價(jià)云南普洱茶不同溶劑提取物體外抗氧化活性。 實(shí)驗(yàn)材料 云南普洱茶 、曬青毛茶（來(lái)自勐海國(guó)艷茶廠） 主要試劑 本試驗(yàn)中主要用到的藥品和試劑見(jiàn)表 1。 7H2O 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 水楊酸 天津市化學(xué)試劑三廠 30%過(guò)氧化氫 天津市化學(xué)試劑三廠 亞硝酸鈉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司 對(duì)氨基苯磺酸 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 N1萘乙二胺鹽酸鹽 天津市化學(xué)試劑研究所 三氯乙酸 中國(guó)前進(jìn)化學(xué)試劑廠 鐵氰化鉀 中國(guó)成都化學(xué)試劑廠 三氯化鐵 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司 磷酸二氫鈉 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 Na2HPO4 7表 2 主要 儀器 Table 2 Main equipents 儀器名稱及規(guī)格 出廠廠家 722 型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司 電子天平（感量為 ） 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司 HH60 水浴鍋 常州市普達(dá)教學(xué)儀器有限公司 移液槍（ ） 大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司 SH10A水分快速測(cè)定儀 上海恒平科學(xué)儀器有限公司 1013ABS 恒溫電熱干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠 RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器廠 BCD208K/A海爾冰箱 海爾集團(tuán)（青島） 研究方 法 待測(cè)樣的提取及水分含量的測(cè)定 不同溶劑提取物的 提取工藝 普洱茶 及其原料經(jīng)打碎過(guò)篩（ 4080目） → 無(wú)水乙醇浸泡 （ 23次，每次一天，溫度為 45℃） → 收集乙醇浸泡液 → 把茶葉晾干，揮去乙醇 → 加入 蒸餾 水（ 分三次浸泡，每次 3小時(shí)，溫度為 50℃，體積比為 1： 5） → 合并濾液，過(guò)濾，除去雜質(zhì)， 75℃減壓濃縮→ 取適量的水提物乙酸乙酯萃取 3次（殘留水層） → 三氯甲烷萃取 23次（殘留水層） →正丁醇萃?。埩羲畬樱?→ 水層加無(wú)水乙醇沉淀， 靜置 1天，過(guò)濾得到沉淀 和醇溶液。 待測(cè)樣水分含量的測(cè)定 采用傳統(tǒng)水分測(cè)定方法或采用 SH10A水分快速測(cè)定儀測(cè)定待測(cè)樣品水分。 SH10A水分快速測(cè)定儀測(cè)定方法：根據(jù) SH10A水分快速測(cè)定儀的測(cè)定原理測(cè)定。 普洱茶及其原料不同溶劑提取物的總抗氧化能力（還原力）的測(cè)定 8 配制試劑 mol／ L， pH6． 6磷酸緩沖溶液的配制：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鈉 ，加水溶解并定容到 1L；準(zhǔn)確稱取 Na2HPO4 12H2O溶液 376 mL，混合定容即可。10％ 三氯乙酸溶液的配制：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸 50g，加水溶解并定容到 500 mL即可。 具體操作 分別取 、 （或 mL、 mL 、 mL、 mL、 mL）的待測(cè)樣液加水至 mL，加入 0． 2mol／ L， pH6． 6磷酸緩沖溶液 2． 5mL及 1％ 鐵氰化鉀 2． 5mL， 50℃水浴 20min后急速冷卻，加入 10％ 三氯乙酸溶液 2． 5mL， 加蒸餾水 6mL，及 0． 1％ FeC13 ，混勻后 10min于 700nm處測(cè)定吸光值， 吸光值越大則還原力越強(qiáng) [9]。 OH的抑制率的測(cè)定 配制試劑 ：準(zhǔn)確稱取 FeSO4，用蒸餾水溶解定容至 100mL。2mmol/L水楊酸的配制：準(zhǔn)確稱取 ，用無(wú)水乙醇溶解定容至 100mL。 OH。 OH氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸光值表示 OH越多。 37℃反應(yīng) 1h，測(cè)定 510nm處的吸光值。 OH效果越好 [9]。 ]自由基 清除能力 的測(cè)定 [10] 實(shí)驗(yàn) 原理 二苯代苦味肼基自由基 [DPPH [DPPH在 [DPPH ]自由基結(jié)合或發(fā)生替代 ， 使 [DPPH因此，可以通過(guò)在 517nm波長(zhǎng)處檢測(cè)普洱茶對(duì) [DPPH [DPPH ]，先用少量甲苯助溶，再用 50%乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)入 100mL容量瓶中，用 50%乙醇定容 ，搖勻得濃度為 mg/mL[DPPH 具體操作 分別取 、 mL、 mL、 mL、 mL待測(cè)溶液于 試管 中，分別加入0 mL、 mL、 mL、 mL、 mL蒸餾水，再依次加入 mL[DPPH 用 1cm比色皿在 517nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值 A值，記為 As。 ]溶液用 1cm比色皿在 517nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光 值 A值，記為 Ao，按 以下公 式計(jì)算自由基清除率 [1112] 。 3mmol/L鄰苯三酚溶液的配制：準(zhǔn)確稱取 ，用 定容至 100mL即可。受試物若能清除 02，則吸光度發(fā)生變化，可間接判斷受試物對(duì) 02的抑制作用。有色中間產(chǎn)物在 322nm有強(qiáng)烈的光吸收。 具體操作 鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定：取 50mmol/L TrisHCl緩沖溶液（ ）， mL蒸餾水混勻后在 25℃水浴中保溫 20min，取出后立即加入在 25℃預(yù)熱過(guò)的 3 mmol/L鄰苯三酚 ，迅速搖勻后倒 入比色杯， 420nm下每隔 30s測(cè)定吸光度 [14]，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘內(nèi)吸光度的增加，以 10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對(duì)照，記錄結(jié)果。同樣以 10 mmol/LHCl溶液配制空白管作為對(duì)照。 計(jì)算抑制率 抑制率（％）＝（△ A1/△ t △ A2/△ t） /△ A1/△ t 100% 式 中： △ A1/△ t—— 鄰苯三酚自氧化時(shí)反應(yīng)速率 。 具體操作 分別量取不同濃度梯度的不同溶劑提取物水溶液、 Vc水溶液放于 25mL具塞試管中，加入 5ug/mL的亞硝酸鈉溶液 lmL然后置于 37℃水浴鍋中反應(yīng) 30min，各加入 ％對(duì)氨基苯磺酸 lmL搖勻靜置 5min；再加入 ％鹽酸萘乙二胺顯色劑 ，靜置15min后，以蒸餾水作空白測(cè)各溶液的吸光度 A，把未加 N02離子清除劑的溶液所測(cè)得的吸光度定為 A0。按以下公式計(jì)算待測(cè)物對(duì) N02的清除率 [15]。 11 3 結(jié)果與分析 普洱茶及其原料 不同溶劑提取物水分含量的比較 采用傳統(tǒng)的水分測(cè)定 方法和快速水分測(cè)定儀測(cè)定樣品的水分含量，測(cè)定結(jié)果如表3。 表 3 不同溶劑提取物的水分含量 Table 3 Extraction of water content from different solvent 不同溶劑提取物 水分含量 (%) 普洱茶 曬青毛茶 乙醇浸提物 水提物 乙酸乙酯提取物 氯仿提取物 正丁醇提取物 醇沉 醇溶液 因此 ,由于樣品水分含量的差異會(huì)導(dǎo)致樣品所配制的濃度存在一定的差異性 ,這種不一致性可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較。根據(jù)還原力的測(cè)定方法測(cè)定提取物的總抗氧化能力的大小見(jiàn)表 4 和表 5。 SD） 水提（普） 177。 177。 177。 177。 177。 乙酸乙酯提（普） 177。 177。 177。 177。 177。 醇溶液（普） 177。 177。 177。 177。 177。 醇沉（普） 177。 177。 177。 177。 177。 氯仿提?。ㄆ眨? 177。 177。 177。 177。 177。 表 5 不同 溶劑提取物不同濃度還原力與蘆丁的對(duì)照 Table 5 Reduction of control of Rutin and different solvent extraction of different concentrations 樣品 不同濃度下的吸光值（平均值 x177。 177。 177。 正丁醇提（原料） 177。 177。 177。 177。 177。 乙醇浸提（ 原料） 177。 177。 177。 177。 177。 13 表 6 不同 溶劑提取物還原力與濃度的相關(guān)系數(shù) Table 6 R2of reducing power of different solvent extractions 水提物（普） 水提物（原料） 乙酸乙酯提 (普 ) 乙酸乙酯提 (原料 ) 醇溶液（普） R2 醇溶液（原料） 醇沉（普） 醇沉（原料） 氯仿提（普） 氯仿提（原料） R2 正丁醇提（普） 正丁醇提（原料） 乙醇浸提（普） 乙醇浸提（原料） 蘆丁 R2 由表 4 和表 5 可以清楚的看出各樣品均具有一定的還原力。同一溶劑提取物因原料不同其總抗氧化能力存在一定的差異。 ，最低為 177。 和 177。在較低濃度 177。 ，即原料的正丁醇提取物的還原力遠(yuǎn)大于蘆丁。 ，普洱茶原料的乙醇浸提物的 吸光值 達(dá)到 177。 。各樣品及對(duì)照的相關(guān)系數(shù)順序?yàn)椋核嵛铮ㄔ希┅兇汲粒ㄔ希┅兇汲粒ㄆ眨┅円掖冀幔ㄔ希┅円掖冀幔ㄆ眨┅兟确绿崛∥铮ㄔ希┅冋〈继崛∥铮ㄆ眨?﹥氯仿提取物（普）﹥醇溶液（普）﹥蘆丁﹥醇溶液（原料）﹥水提物（普）﹥正丁醇提取物（原料）﹥ 乙酸乙酯提取物（普）﹥乙酸乙酯提取物（原料）。 14 由圖 1 可知，在濃度均為 ：正丁醇提取物（原料）﹥乙酸乙酯提取物（原料）﹥蘆丁﹥乙醇浸提物（原料）﹥正丁醇提取物（普）﹥乙酸乙酯提取物（普）﹥水提物（普）﹥醇溶液（原料）﹥乙醇浸提物（普）﹥水提物（原料）﹥醇溶液（普） ﹥醇沉（普）﹥醇沉（原料）﹥氯仿提取物（普）﹥氯仿提取物（原料）。 普洱茶及其原料不同溶劑提取物對(duì)羥自由基（ OH）的抑制效果的分析 根據(jù)公式抑制率（％）＝ [A0（ AiA0i） ]/A0 100%計(jì)算抑制率，則可得出 提取物及對(duì)照 Vc 對(duì)羥自由基（ 圖１各樣品在相同濃度下的還原力F i g . 1 R e d u c i n g p o w e r o f th e s a m p l e s i n th e s a m e c o n c e n tr a ti o n0水提物（普）水提物（原料）乙酸乙酯提（普）乙酸乙酯提（原料）醇溶液（普）醇溶液（原料）醇沉（普）醇沉（原料） 氯仿提（普）氯仿提（原料） 正丁醇提（普）正丁醇提（原料）乙醇浸提（普）乙醇浸提（原料）蘆丁吸光值A(chǔ)700nm 15 表 7 不 同 溶劑提取物不同濃度對(duì) 羥基自由基（ OH）的抑制率（％） （平均值ⅹ177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 17