13基因工程的操作過程2-在線瀏覽
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【正文】 G 539。 G CTTAA 539。 539。 539。 GGATC CCTAG GATCC 539。 GAATT CTTAA 539。 539。 539。 G G 339。 GCATG 339。 C 339。 C 退火 Pst I Pst I C 339。 G G 339。 539。 539。 539。 539。 G G 539。 C 539。 G T4DNA ligase TdT TdT dTTP dATP GTTTTTTTTTT 339。 TTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAA 339。 AAAAAAAAAAC 539。 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG S1 C 339。 539。 539。 G 539。 539。 GGATC CCTAG 539。 539。 539。 6. 重組率 （ 2）提高重組率的方法 提高外源 DNA片段與載體的分子比 ： 5 : 1 10 : 1 載體 DNA分子在連接前先除去磷酸基團： 539。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 539。 p 539。 539。 HO 退火 539。 G AATTC CTTAAG OH HO OH HO 堿性磷酸單酯酶 堿性磷酸單酯酶 重組率 （ 2）提高重組率的方法 加裝同聚尾末端： CTGCA 339。 ACGTC 539。 C 539。 GTACG T4DNA ligase TdT TdT dCTP dGTP GCATGCCCCCC 339。 CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 339。 GGGGGGACGTC 539。 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 539。 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow 二、 重組 DNA分子 的轉化和擴增（轉與增） 第十三章 基因工程的操作過程 轉化的原理與技術 轉化率 轉化細胞的擴增 1. 轉化的原理與技術 （ 1） Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉化 Ca2+誘導的完整細胞的轉化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等）， 1970年建立此技術，其原理是 Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做 感受態(tài) 1. 轉化的原理與技術 （ 1） Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉化 大腸桿菌感受態(tài)細胞 的制備： 100 ml 菌體培養(yǎng)至 OD600 = ， 離心收集菌體 用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心 用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2溶液懸浮菌體 冰浴放置 12 24小時，備用 收集菌體 1. 轉化的原理與技術 （ 1） Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉化 大腸桿菌感受態(tài)細胞 的質粒轉化： 取 100 ml 感受態(tài)細胞，加入相當于 50 ng 載體的重組 冰浴放置半小時 在 42℃ 保溫 2 分鐘（熱脈沖） 快速將轉化細胞轉移至冰浴中放置 1 2分鐘 DNA連接液，混勻 加入 1 ml 新鮮培養(yǎng)基， 于 37℃ 培養(yǎng) 1 小時（擴增） 涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選 1. 轉化的原理與技術 （ 2）細菌原生質體的轉化 革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源 DNA的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常采用原生質體（細胞去壁后的形態(tài)）轉化的方法轉移質?；蛑亟M DNA分子 酵母菌、霉菌、植物細胞 也可用原生質體法進行轉化 （ 2）細菌原生質體的轉化 不同細菌的原生質體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如 34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細菌細胞壁對溶菌酶的敏感性。與原生質體接觸的所有器皿應保持無水無去污劑 細菌原生質體 的制備： 1. 轉化的原理與技術 （ 2）細菌原生質體的轉化 取 1ml的原生質體懸浮液（ 108109個原生質體），加入 10 20 ml DNA重組連接液，同時加入含有 PEG1000和 Ca2+的等滲溶液，混勻 細菌原生質體 的轉化： 細菌原生質體 的再生 ： 原生質體再生的主要目的是使細菌重新長出細胞壁。 在強大電場的作用下 ， 細菌細胞壁和細胞膜產生縫隙 ， 質粒或 DNA重組分子便可進入細胞內 電穿孔轉化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y構的受體細胞均有效，但轉化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質粒消除實驗 2. 轉化率 （ 1）轉化率的定義 轉化率是衡量轉化效率的重要指標，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉化條件下進入受體細胞的分子數(shù)。 一 微克 pUC18共有 分子 （ / 2686X660） ， 也就是說 ， 每 3400個 pUC18分子才有 一 個分子進入受體細胞 另一方面 ， 在實際操作過程中 ， 轉化 一 微克 pUC18共需 2ml感受態(tài)細胞 ， 大約含有 2X1010個大腸桿菌細胞 ， 也就是說 ， 每200個細胞只有一個細胞能接納 pUC18 DNA 2. 轉化率 （ 2）轉化率的用途 利用轉化率和重組率等參數(shù)可以幫助設計 DNA重組實驗規(guī)模 例如， 某一 DNA重組實驗的重組率為 20%，轉化率為 107/mg載體， 經切接處理后的載體轉化率比天然的載體低 100倍，欲獲得 104個 重組克隆，需投入多少載體 DNA進行重組實驗？ 若重組率為 100%，則轉化后產生 104個重組克隆需要： 104 / 107 X 10 2 = mg 載體 DNA 考慮到實驗系統(tǒng)的重組率為 20%，所以實際投入載體應為： / 20% = mg 載體 DNA
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