13基因工程的操作過程2-在線瀏覽
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【正文】 G 539。 G CTTAA 539。 539。 539。 GGATC CCTAG GATCC 539。 GAATT CTTAA 539。 539。 539。 G G 339。 GCATG 339。 C 339。 C 退火 Pst I Pst I C 339。 G G 339。 539。 539。 539。 539。 G G 539。 C 539。 G T4DNA ligase TdT TdT dTTP dATP GTTTTTTTTTT 339。 TTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAA 339。 AAAAAAAAAAC 539。 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG S1 C 339。 539。 539。 G 539。 539。 GGATC CCTAG 539。 539。 539。 6. 重組率 （ 2）提高重組率的方法 提高外源 DNA片段與載體的分子比 ： 5 : 1 10 : 1 載體 DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)： 539。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 539。 p 539。 539。 HO 退火 539。 G AATTC CTTAAG OH HO OH HO 堿性磷酸單酯酶 堿性磷酸單酯酶 重組率 （ 2）提高重組率的方法 加裝同聚尾末端： CTGCA 339。 ACGTC 539。 C 539。 GTACG T4DNA ligase TdT TdT dCTP dGTP GCATGCCCCCC 339。 CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 339。 GGGGGGACGTC 539。 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 539。 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow 二、 重組 DNA分子 的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增） 第十三章 基因工程的操作過程 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) 轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等）， 1970年建立此技術(shù)，其原理是 Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做 感受態(tài) 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 的制備： 100 ml 菌體培養(yǎng)至 OD600 = ， 離心收集菌體 用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心 用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2溶液懸浮菌體 冰浴放置 12 24小時(shí)，備用 收集菌體 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化： 取 100 ml 感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于 50 ng 載體的重組 冰浴放置半小時(shí) 在 42℃ 保溫 2 分鐘（熱脈沖） 快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置 1 2分鐘 DNA連接液，混勻 加入 1 ml 新鮮培養(yǎng)基， 于 37℃ 培養(yǎng) 1 小時(shí)（擴(kuò)增） 涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 革蘭氏陽性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源 DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟M DNA分子 酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞 也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化 （ 2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長(zhǎng)在高滲培養(yǎng)基中（如 34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無水無去污劑 細(xì)菌原生質(zhì)體 的制備： 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 取 1ml的原生質(zhì)體懸浮液（ 108109個(gè)原生質(zhì)體），加入 10 20 ml DNA重組連接液，同時(shí)加入含有 PEG1000和 Ca2+的等滲溶液，混勻 細(xì)菌原生質(zhì)體 的轉(zhuǎn)化： 細(xì)菌原生質(zhì)體 的再生 ： 原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁。 在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下 ， 細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙 ， 質(zhì)?；?DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn) 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 1）轉(zhuǎn)化率的定義 轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。 一 微克 pUC18共有 分子 （ / 2686X660） ， 也就是說 ， 每 3400個(gè) pUC18分子才有 一 個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞 另一方面 ， 在實(shí)際操作過程中 ， 轉(zhuǎn)化 一 微克 pUC18共需 2ml感受態(tài)細(xì)胞 ， 大約含有 2X1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞 ， 也就是說 ， 每200個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞能接納 pUC18 DNA 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 2）轉(zhuǎn)化率的用途 利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì) DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模 例如， 某一 DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為 20%，轉(zhuǎn)化率為 107/mg載體， 經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低 100倍，欲獲得 104個(gè) 重組克隆，需投入多少載體 DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？ 若重組率為 100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生 104個(gè)重組克隆需要： 104 / 107 X 10 2 = mg 載體 DNA 考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為 20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為： / 20% = mg 載體 DNA
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