13基因工程的操作過程2-wenkub
2023-02-02 04:26:55 本頁面
【正文】 EcoRI 539。 539。 GGATC CCTAG 539。 G 539。 539。 AAAAAAAAAAC 539。 G T4DNA ligase TdT TdT dTTP dATP GTTTTTTTTTT 339。 G G 539。 539。 539。 C 退火 Pst I Pst I C 339。 GCATG 339。 539。 GAATT CTTAA 539。 539。 G CTTAA 539。 539。 C G 539。 GGATCG CCTAGC 539。 CTGCA G 539。 539。 T ACTAG 539。 539。 GATCA T 539。 G CCTAG GATCC G 539。 539。 G CTTAA 539。 AATTC G 539。 G CTTAA AATTC G 539。基因工程 第十三章 基因工程的操作過程 第十三章 基因工程的操作過程 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 二、 重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)、增） 一、 DNA的體外重組（切、接） 第十三章 基因工程的操作過程 切 接 轉(zhuǎn) 增 檢 一、 DNA的體外重組（切與接） 第十三章 基因工程的操作過程 同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 不同粘性末端的連接 粘性末端的更換 人工粘性末端的連接 重組率 539。 539。 退火 G CTTAA AATTC G 539。 AATTC G T4DNA ligase GAATTC CTTAAG 539。 GAATTC CTTAAG 2. 同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 BamHI 539。 539。 退火 G CCTAG GATCC G 539。 GGATCA CCTAGT 539。 GATCA T TGATCC ACTAGG 539。 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 539。 G ACGTC 339。 CTGCAG GACGTC 539。 G C Klenow 補平 539。 GGATCG CCTAGC 4. 人工粘性末端的連接 5‘突出末端 539。 539。 Klenow 補平 Klenow 補平 539。 539。 GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG 退火 BamH I BamH I EcoR I BamH I 3‘突出末端 CTGCA 339。 C 539。 CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 339。 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 539。 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG 539。 G 339。 C 退火 C 339。 539。 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG 加熱 GT CA T T T T T T T T TG A A AAAA A A AC CA GT A A A A A A A A AC T T TTTT T T TG TG AC CA GT 5. 粘性末端的更換 BamHI 539。 G CCTAG 539。 GATCC CTAGG 539。 EcoR I GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker 6. 重組率 （ 1）重組率的定義 重組率 = 含有外源 DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù) 在常規(guī)實驗條件下 ， 重組率一般為 25 75% 重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標 ， 較高的重組率可以 大大簡化 DNA重組的后續(xù)操作 。 G CTTAA p AATTC G 539。 AATTC G 539。 G G 339。 C 339。 G G 339。 539。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素 （ 3） l噬菌體 DNA的轉(zhuǎn)染 感受態(tài)細胞的培養(yǎng)： 將大腸桿菌在含有麥芽糖 （ 不含葡萄糖 ） 和 MgCl2的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至 OD600 = 吸附： 加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液 ， 30℃ 保溫 10分鐘 轉(zhuǎn)染裂解： 加入 20倍體積的新鮮培養(yǎng)基， 30℃ 培養(yǎng) 2小時，直至培養(yǎng)液 中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選 （ 4） 電穿孔轉(zhuǎn)化 將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；?DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中 ， 兩極施加高壓電場 。在實驗時，擴增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的 37℃ 培養(yǎng)一個小時 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程 l噬菌體轉(zhuǎn)染后的 30℃ 培養(yǎng)等，均屬擴增操作 3. 轉(zhuǎn)化細胞的擴增 （ 2）擴增操作的目的 增殖轉(zhuǎn)化細胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細胞用于篩選程序 擴增和表達載體分子上的標記基因，便于篩選 表達外源基因，便于篩選和鑒定 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過程 （一）載體遺傳標記檢測 （二）克隆 DNA序列檢測 （三）外源基因產(chǎn)物檢測 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過程 由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子、 重組子 與非重組子、 目的重組子 與非目的重組子 轉(zhuǎn)化子 重組子 目的重組子 （一） 載體遺傳標記檢測 抗藥性篩選法 ROP
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1