13基因工程的操作過程2(已改無錯字)
2023-02-02 04:26:55 本頁面
【正文】 P dTTP TR dTMP dTDP dTTP AP TK AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶 （一）載體遺傳標記檢測 顯色篩選法 （ 1）顯色篩選法的基本原理： 顯色篩選法可以區(qū)分 轉化子 與非轉化子，也可區(qū)分 重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產物能使細胞產生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質粒 pUC18攜帶的 lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質粒pIJ702攜帶的 melC基因（黑色反應）等 （ 2）顯色篩選法的基本操作： pUC18 Ap r lacZ39。 ori Ap + Xgal 重組子（ Apr + lacZ） 將外源基因克隆在 pUC18的 lacZ’標記 基因內部 ， 使之滅活 ， 此時重組子呈 Apr、 lacZ， 淡黃色菌落；而非重組子則呈 Apr、 lacZ+， 藍色菌落 （二） 克隆 DNA序列檢測 限制性酶切圖譜法 所謂的 限制性酶切圖譜法 就是對載體上插入的外源 DNA片段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分 重組子 與非重組子，而且還能鑒定目的重組子 。但這種方法在用于數千規(guī)模的轉化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。 限制性酶切圖譜法 （ 1）全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P kb kb kb 區(qū)分重組子與非重組子 用 BamHI酶切轉化子質粒 DNA 電泳觀察酶解產物片段 重組子： kb + kb 非重組子： kb 如果外源 DNA片段也是 kb， 最好選用單一切口的酶將質粒線型化，然 后通過其長度來鑒定其是否為重組子 限制性酶切圖譜法 （ 1）全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori S S B P kb kb kb 區(qū)分重組子與非重組子 如果外源 DNA片段插在 pUC18的SphI位點處，原則上也可用 SphI酶解鑒定，但這樣做很不經濟，因為 SphI非常昂貴（每 100單位50美元）。用 HindIII和 EcoRI聯合酶解同樣可以達到目的，但這兩種酶的價格只及 SphI的 1 / 50 限制性酶切圖譜法 全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P kb kb kb 區(qū)分目的重組子與非目的重組子 用 EcoRI酶切轉化子質粒 DNA 目的重組子： kb + kb 或者： kb + kb 用 PstI酶切轉化子質粒 DNA 目的重組子： kb + kb 或者： kb + kb pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E kb kb kb 區(qū)分目的重組子與非目的重組子 對圖示的克隆片段，轉化子質粒DNA用 EcoRI酶切開后，只出現 kb和 kb兩條帶子，實際上 kb的條帶中含有兩種不同的分子 kb kb E （二）克隆 DNA序列檢測 限制性酶切圖譜法 （ 2）部分酶解圖譜法： kb PstI EcoRI BamHI B B E kb kb E B 該重組質粒經酶解后，分別得到下列幾組數據： BamHI全酶解： kb BamHI+EcoRI全酶解： kb 其中 ， kb片段的存在表明該片段位于一端 BamHI部分酶解： kb 其中 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表 明兩者是連在一起的；同理 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表明兩者是連在一起的；最后 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表明兩者 是連在一起的 （二）克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據克隆的目的基因或 DNA片段的 同源序列 設計并合成 探針 ，以此搜尋篩選含有目的基因的 目的重組子 。其中， DNA同源序列之間的特異性互補雜交是該技術的基本理論依據 （二）克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 菌落原位雜交法的基本操作： 影印 用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板 洗滌 雜交 感光 用 NaOH溶液浸泡影印薄膜 用 SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80℃ 烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫 用 SSCSDS液洗滌雜交薄膜 用 X光膠片覆蓋薄膜感光 （二）克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 1）雜交探針的制備： 用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件： 單鏈結構 （ 雙鏈 DNA可用堿變性 ） 足夠長度 （ 至少 12個 堿基 ） 內部不含互補區(qū) 探針的制備方法或來源包括： 人工合成 cDNA合成 同源序列 mRNA GACCTA AAGCGGATCG TAGGTCGACCTACTGGATA AG CTGGGC A（二）克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標記： 5‘ HO 3‘ HO OH 3‘ OH 5‘ T4PNP Mg2+ pppATP（ g32PATP） 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ (二） 克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標記 ： 介導的反轉錄標記 3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT 5’mRNA 反轉錄酶 Mg2+ dNTP + pppdAT
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