13基因工程的操作過(guò)程2-文庫(kù)吧
2025-01-04 04:26 本頁(yè)面
【正文】 AAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG S1 C 339。 539。 539。 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG 加熱 GT CA T T T T T T T T TG A A AAAA A A AC CA GT A A A A A A A A AC T T TTTT T T TG TG AC CA GT 5. 粘性末端的更換 BamHI 539。 539。 GGATCC CCTAGG T4DNA ligase Klenow 補(bǔ)平 GATCC 539。 G 539。 G CCTAG 539。 539。 539。 GGATC CCTAG 539。 GATCC CTAGG 539。 539。 GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG 539。 539。 EcoR I GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker 6. 重組率 （ 1）重組率的定義 重組率 = 含有外源 DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù) 在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下 ， 重組率一般為 25 75% 重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo) ， 較高的重組率可以 大大簡(jiǎn)化 DNA重組的后續(xù)操作 。 6. 重組率 （ 2）提高重組率的方法 提高外源 DNA片段與載體的分子比 ： 5 : 1 10 : 1 載體 DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)： 539。 539。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 539。 G CTTAA p AATTC G 539。 p 539。 G CTTAA OH 539。 539。 AATTC G 539。 HO 退火 539。 GAATTC CTTAA G 539。 G AATTC CTTAAG OH HO OH HO 堿性磷酸單酯酶 堿性磷酸單酯酶 重組率 （ 2）提高重組率的方法 加裝同聚尾末端： CTGCA 339。 G G 339。 ACGTC 539。 GCATG 339。 C 539。 C 339。 GTACG T4DNA ligase TdT TdT dCTP dGTP GCATGCCCCCC 339。 C 退火 C 339。 CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 339。 G G 339。 GGGGGGACGTC 539。 539。 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 539。 539。 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow 二、 重組 DNA分子 的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增） 第十三章 基因工程的操作過(guò)程 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) 轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等）， 1970年建立此技術(shù)，其原理是 Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做 感受態(tài) 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 的制備： 100 ml 菌體培養(yǎng)至 OD600 = ， 離心收集菌體 用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心 用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2溶液懸浮菌體 冰浴放置 12 24小時(shí)，備用 收集菌體 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化： 取 100 ml 感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于 50 ng 載體的重組 冰浴放置半小時(shí) 在 42℃ 保溫 2 分鐘（熱脈沖） 快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置 1 2分鐘 DNA連接液，混勻 加入 1 ml 新鮮培養(yǎng)基， 于 37℃ 培養(yǎng) 1 小時(shí)（擴(kuò)增） 涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源 DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟M DNA分子 酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞 也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化 （ 2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長(zhǎng)在高滲培養(yǎng)基中（如 34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。在制備過(guò)程中，菌體應(yīng)始終懸浮在 %的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無(wú)水無(wú)去污劑 細(xì)菌原生質(zhì)體 的制備： 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 取 1ml的原生質(zhì)體懸浮液（ 108109個(gè)原生質(zhì)體），加入 10 20 ml DNA重組連接液，同時(shí)加入含有 PEG1000和 Ca2+的等滲溶液，混勻 細(xì)菌原生質(zhì)體 的轉(zhuǎn)化： 細(xì)菌原生質(zhì)體 的再生 ： 原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素 （ 3） l噬菌體 DNA的轉(zhuǎn)染 感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)： 將大腸桿菌在含有麥芽糖 （ 不含葡萄糖 ） 和 MgCl2的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至 OD600 = 吸附： 加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液 ， 30℃ 保溫 10分鐘 轉(zhuǎn)染裂解： 加入 20倍體積的新鮮培養(yǎng)基， 30℃ 培養(yǎng) 2小時(shí)，直至培養(yǎng)液 中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選 （ 4） 電穿孔轉(zhuǎn)化 將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；?DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中 ， 兩極施加高壓電場(chǎng) 。 在強(qiáng)大電場(chǎng)的作
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