【文章內(nèi)容簡介】 用下 ， 細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙 ， 質(zhì)?；?DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 1）轉(zhuǎn)化率的定義 轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗規(guī)模下，每個受體細(xì)胞最多只能接受一個載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體 DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納 DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長） 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 1）轉(zhuǎn)化率的定義 例如 ， pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為 108， 即每微克 pUC18中只有 108個分子能進(jìn)入受體細(xì)胞 。 一 微克 pUC18共有 分子 （ / 2686X660） ， 也就是說 ， 每 3400個 pUC18分子才有 一 個分子進(jìn)入受體細(xì)胞 另一方面 ， 在實(shí)際操作過程中 ， 轉(zhuǎn)化 一 微克 pUC18共需 2ml感受態(tài)細(xì)胞 ， 大約含有 2X1010個大腸桿菌細(xì)胞 ， 也就是說 ， 每200個細(xì)胞只有一個細(xì)胞能接納 pUC18 DNA 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 2）轉(zhuǎn)化率的用途 利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計 DNA重組實(shí)驗規(guī)模 例如， 某一 DNA重組實(shí)驗的重組率為 20%，轉(zhuǎn)化率為 107/mg載體， 經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低 100倍，欲獲得 104個 重組克隆，需投入多少載體 DNA進(jìn)行重組實(shí)驗？ 若重組率為 100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生 104個重組克隆需要： 104 / 107 X 10 2 = mg 載體 DNA 考慮到實(shí)驗系統(tǒng)的重組率為 20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為： / 20% = mg 載體 DNA 載體投入量確定后，外源 DNA的投入量即可按 10∶ 1的要求算 出（ 5 mg），甚至 還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 3）轉(zhuǎn)化率的影響因素 a. 載體及 DNA重組分子方面： 載體本身的性質(zhì)： 不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同 載體的空間構(gòu)象： 質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個數(shù)量級 插入片段的大小： 對質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 3）轉(zhuǎn)化率的影響因素 b. 受體細(xì)胞方面： 受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如： pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌 ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 3）轉(zhuǎn)化率的影響因素 ： 受體細(xì)胞的預(yù)處理： 影響最大 供受體的比例： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 ml 感受態(tài) 細(xì)胞 50 ng DNA 轉(zhuǎn)化方法 ： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 106 107 / mg DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 109 個 原生質(zhì)體 50 ng DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 105 106 / mg DNA lDNA轉(zhuǎn)染 107 108 / mg DNA 電穿孔轉(zhuǎn)化 106 109 / mg DNA 3. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增 （ 1）擴(kuò)增操作 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時間培養(yǎng)。在實(shí)驗時，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的 37℃ 培養(yǎng)一個小時 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程 l噬菌體轉(zhuǎn)染后的 30℃ 培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作 3. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增 （ 2）擴(kuò)增操作的目的 增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序 擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選 表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過程 （一）載體遺傳標(biāo)記檢測 （二）克隆 DNA序列檢測 （三）外源基因產(chǎn)物檢測 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過程 由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子、 重組子 與非重組子、 目的重組子 與非目的重組子 轉(zhuǎn)化子 重組子 目的重組子 （一） 載體遺傳標(biāo)記檢測 抗藥性篩選法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r （ 1）抗藥性篩選法的基本原理： pBR322 4363 bp ori 抗藥性篩選法可區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與 非轉(zhuǎn)化子、重組子 與 非重組子 將外源 DNA片段插在 EcoRI位點(diǎn)： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcr 將外源 DNA片段插在 BamHI位點(diǎn)： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcs （ 2）抗藥性篩選法的基本操作： 先將轉(zhuǎn)化液涂布含有 Ap的平板 再將 Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至 含有 Ap和 Tc的平板上 在 Ap平板上生長、但在 Ap和 Tc平板上 不長的轉(zhuǎn)化子即為 重組子 Ap Ap + Tc 影印 挑選 （一） 載體遺傳標(biāo)記檢測 營養(yǎng)缺陷型篩選法 （ 1）營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理： 營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與 非轉(zhuǎn)化子 ，一般不能區(qū)分 重組子 與 非重組子 。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子 （ 2）常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記： 哺乳動物細(xì)胞中存在兩條 dTTP的合成途徑： 用于 大腸桿菌 的營養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因 trp+ 用于高等 哺乳動物 細(xì)胞的營養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因 tk， 相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇 tk缺陷型 dCDP dTD