【正文】 系快速增殖，隨后又發(fā)展了能支持原代培養(yǎng)的各種神經(jīng)元生長的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基在許多實驗室里已取代了有血清培養(yǎng)。更為重要的是，它們可用來檢測生長因子以及其他促進(jìn)神經(jīng)元存活或生長的因子，或者用來檢測那些可保護(hù)神經(jīng)元免遭環(huán)境毒物損傷的制劑。 血清中含有的組分，例如血清蛋白，可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養(yǎng)基中。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中過氧化物和超氧化物的累積，有報道講可以促進(jìn)低密度培養(yǎng)細(xì)胞的存活。因而，無血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑的試劑。上述這些影響在高密度培養(yǎng)時變小，特別是神經(jīng)元與膠質(zhì)共培養(yǎng)時，它們可以吸收和代謝神經(jīng)元毒性物質(zhì)如谷氨酸 應(yīng)該注意，盡管無血清培養(yǎng)基是有化學(xué)限定性的，但在培養(yǎng)過程中它仍有變動，培養(yǎng)起始時可能有些物質(zhì)缺乏，而后細(xì)胞的產(chǎn)物可能積累，從而使培養(yǎng)基的成分改變。 生長因子絕大多數(shù)哺乳類胚胎神經(jīng)元有嚴(yán)格的營養(yǎng)要求，若不能提供適宜的生長因子或合適的因子組分，將會使絕大多數(shù)神經(jīng)元在體外培養(yǎng)的數(shù)天中死亡。如果細(xì)胞混合物能在高密度時生長，所需的生長因子便會積累到可觀的數(shù)值，尤其當(dāng)培養(yǎng)基很少變化時。但是，這種對營養(yǎng)（生長）因子自身倚賴性亦有弊端，因為通常在混合細(xì)胞群體中細(xì)胞很難有同比例增殖，某些細(xì)胞會因生長條件的貧乏而受限制。因為培養(yǎng)基的條件在細(xì)胞的較低密度時變的不夠有效。 滿足神經(jīng)元營養(yǎng)需求的第二條途徑是向培養(yǎng)基中加入生長因子。不過，只有少數(shù)對這種蛋白質(zhì)有反應(yīng)的細(xì)胞類型的細(xì)胞才能生長。例如，大鼠交感神經(jīng)元僅需NGF即能存活，在其生存期間，這些神經(jīng)元可在嚴(yán)格局限條件下生長好幾個月（即在無血清培養(yǎng)基中、或缺乏膠質(zhì)細(xì)胞、或在化學(xué)限定基質(zhì)上）。然而，交感神經(jīng)元也對來自膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）有反應(yīng)，還有NTLIF與CNTF也對其有作用。在離體與活體營養(yǎng)需求之間的差別或許可以用在不同環(huán)境中NGF含量和分布的不同來解釋，培養(yǎng)中的NGF彌散在整個環(huán)境中，而在活體內(nèi)，大部分區(qū)域的含量是有限的。盡管在大多數(shù)實驗中已經(jīng)習(xí)慣了營養(yǎng)因子的最大效應(yīng)使用量，其他營養(yǎng)因子的協(xié)同效應(yīng)在亞優(yōu)劑量下更容易觀察到。相應(yīng)的，低濃度的營養(yǎng)因子可能用來檢查表現(xiàn)型，例如對自由基或氨基酸的毒性刺激劑量的反應(yīng)。不過，這些模型也有局限性。大鼠背根神經(jīng)節(jié)含有好幾種細(xì)胞群體，其中小細(xì)胞群、包括nocioceptive cell，對NGF有反應(yīng)，但其他神經(jīng)元，例如大細(xì)胞群中的proprioception 卻對不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子有反應(yīng)。 現(xiàn)有的證據(jù)已表明，CNS神經(jīng)元的營養(yǎng)需求比PNS的更復(fù)雜。例如，至少發(fā)現(xiàn)了15種不同的分子可在離體條件下增加神經(jīng)元的存活。因此，大多數(shù)影響運(yùn)動神經(jīng)元及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的營養(yǎng)因子僅僅只能支持神經(jīng)元的亞群，而神經(jīng)元的最佳存活要求諸多因子的結(jié)合。這一結(jié)果的普遍性尚待進(jìn)一步的證實，但敲除單一的營養(yǎng)因子基因之后，沒有表現(xiàn)出對CNS大多類群的神經(jīng)元的存活產(chǎn)生太大影響，這一觀察與上述的事實是一致的。 四、抗生素 在細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的抗生素是青霉素（常用濃度是25~100ui/ml）與鏈霉素（25~100μg/ml）。在一些實驗室里，它們常規(guī)加入所有的培養(yǎng)基中。以上這些試劑對霉菌與酵母菌的污染均無效。其次，盡管認(rèn)為抗生素對細(xì)胞代謝的影響可忽略，但最好避免使用它們，以免細(xì)胞生長環(huán)境的不穩(wěn)定。 五、抗有絲分裂劑 某些DNA合成抑制劑對分裂細(xì)胞有毒，但對沒有DNA合成的細(xì)胞僅有輕微影響。這樣的試劑常常用于神經(jīng)元的培養(yǎng)，以消除或減少非神經(jīng)元群體。但是，某些細(xì)胞在它的細(xì)胞周期的某些時相時對抗有絲分裂劑是不敏感的。在CNS神經(jīng)元的培養(yǎng)中抗有絲分裂劑常常在星形細(xì)胞形成單層后加入，此時，星形細(xì)胞由于接觸抑制而終止了DNA的合成（即細(xì)胞停止增殖），它們不會因抗有絲分裂劑的加入而死亡。有兩種抗有絲分裂劑常用于神經(jīng)元的培養(yǎng)：Fluorodexyuridine，是胸苷合成酶抑制劑，一般使用濃度為～10μM。另外，阿糖胞苷也常被使用，其使用濃度為5～50μM。阿糖胞苷在很低的濃度下，也會對某些種類的神經(jīng)元有毒性，可以造成特定神經(jīng)原的死亡。 六、培養(yǎng)的保持 培養(yǎng)物是應(yīng)該保持在孵箱中的。對于某些細(xì)胞的生長，包括神經(jīng)原，應(yīng)使氧含量處在一個較低的水平。 高濕度可避免培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基的蒸發(fā)，保持孵箱中的濕度通常是在箱底部放上一大盆水，這水應(yīng)該經(jīng)常換，乘水容器應(yīng)經(jīng)常消毒以防霉菌生長。當(dāng)培養(yǎng)物必須要長期保持在孵箱中時，應(yīng)采用較少培養(yǎng)基的瓶、皿，且將蓋子蓋緊以避免蒸發(fā)，或采用相應(yīng)的按比例供空氣的孵箱。細(xì)胞在低溫時可有較長時間的忍耐限度，但當(dāng)溫度升至39℃時，幾小時內(nèi)即死亡。例如培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞時，要經(jīng)常換液以使其增殖達(dá)到最大。大腦皮質(zhì)的培養(yǎng)要求在不換液的情形下維持一個月以上。 細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇 編輯本段回目錄選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考： (1 ）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。 (2) 其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。如小鼠細(xì)胞株多選 RPMI1640 。 細(xì)胞系 細(xì)胞類型 種 組 織 培養(yǎng)基 293 成纖維細(xì)胞 人 胚胎腎 MEM, 10% 熱滅活馬血清 IMR90 成纖維細(xì)胞 人 肺 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA W138 成纖維細(xì)胞 人 胚胎肺,3月妊娠 MEM, 10% 胎牛血清 A549 上皮細(xì)胞 人 肺癌 F12K, 10%胎牛血清 A431 上皮型 人 表皮細(xì)胞癌 DMEM, 10% 胎牛血清 BHL100 上皮細(xì)胞 人 乳房 McCoy’5A, 10% 胎牛血清 BeWo 上皮滋養(yǎng)層 人 絨毛癌 F12K, 15%胎牛血清 Caco2 上皮細(xì)胞 人 結(jié)腸腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA Chang 上皮細(xì)胞 人 肝臟 BME, 10% 小牛血清 HCT15 上皮細(xì)胞 人 結(jié)腸直腸腺癌 RPMI1640, 10% 胎牛血清 HeLa 上皮細(xì)胞 人 子宮頸癌 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA(in suspension, SMEM) HEpG2 上皮細(xì)胞 人 肝細(xì)胞癌 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA HEp2 上皮細(xì)胞 人 喉癌 MEM, 10% 胎牛血清。包括： 1．天然培養(yǎng)基 指來自動物體液或利用組織分離提取的一些培養(yǎng)基，如動物血漿、胚胎浸出液、血清和 ...... 人工模擬細(xì)胞體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)物質(zhì),它是提供細(xì)胞營養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。 2．合成培養(yǎng)基 人工設(shè)計、配制的培養(yǎng)基，如MEM、19DMEM、RPMI1640等 目錄? 細(xì)胞培養(yǎng)基的分類? 細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇 細(xì)胞培養(yǎng)基的分類編輯本段回目錄培養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如MEM）和添加劑（如血清或無血清培養(yǎng)用的某些確定的激素及生長因子）組成，培養(yǎng)基的配方一直在改進(jìn)，其中包括抗生素和抗有絲分裂劑等等。最廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。MEM/F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2，形成神經(jīng)生物學(xué)最通用的培養(yǎng)基。選擇某種培養(yǎng)基，應(yīng)仔細(xì)了解成分表，應(yīng)知道大多數(shù)情形下培養(yǎng)基都有不足。F12中含有硫酸亞鐵，據(jù)報道也有神經(jīng)毒效應(yīng)。%或者加入丙酮酸（若培養(yǎng)基中這兩種物質(zhì)缺乏時）。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成成分是建立在對不同細(xì)胞系生長的研究之上的，但通常在原代培養(yǎng)中使用也能有比較令人滿意的結(jié)果。實際操作中并非如此簡單。Leiboviz`s L15培養(yǎng)基可用來在大氣環(huán)境中令神經(jīng)細(xì)胞生長，該培養(yǎng)基采用了與眾不同的BSS作基礎(chǔ)，它含有高濃度的氨基酸來提高緩沖能力，培養(yǎng)基中使用半乳糖作碳源，以阻止培養(yǎng)基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產(chǎn)生。L15培養(yǎng)基已用來成功的培養(yǎng)了外周神經(jīng)元，但尚未在CNS神經(jīng)元的發(fā)育研究中全面檢測過。 該培養(yǎng)基比Eagle’s MEM多8種氨基酸、4種維生素、丙酮酸、4種核苷、4種脫氧核苷。 RT Dulbecco’s Modified Eagle Medium ① 0688100g 。該培養(yǎng)基比Eagle’s MEM氨基酸濃度多2倍、維生素濃度多4倍，并含有甘氨酸、L絲氨酸、丙酮酸鹽和微量鐵離子。 RT Dulbecco’s Modified Eagle Medium ② 05919100g ( for 1L) Nissui 不含L谷氨酸、碳酸氫鈉。該培養(yǎng)基比Eagle’s MEM氨基酸濃度多2倍、維生素濃度多4倍，并含有甘氨酸、L絲氨酸、丙酮酸鹽和微量鐵離子。 RT Eagle’s MEM ① 13788987962021502729776221trade05900100g 。能高壓滅菌（121℃，15分鐘）。 RT Eagle’s MEM ② 05901100g ( for 1L) Nissui 含有卡那霉素，不含酚紅、L谷氨酸、碳酸氫鈉。 RT Eagle’s MEM ③ 05902100g ( for 1L) Nissui 不含卡那霉素、酚紅、L谷氨酸、碳酸氫鈉。 RT Eagle’s MEM ④ 05903100g ( for 1L) Nissui 含有卡那霉素，不含L谷氨酸、碳酸氫鈉。能高壓滅菌（121℃，15分鐘）。 RT ES Medium 05971100g ( for 1L) Nissui 含有卡那霉素，不含L谷氨酸、碳酸氫鈉。該培養(yǎng)基比Eagle’s MEM多添加了7種氨基酸、丙酮酸鈉和維生素B12。該培養(yǎng)基用于克隆哺乳動物細(xì)胞的增殖，特別用于中國田鼠細(xì)胞。 0681500g ( for 1L) Nissui 不含碳酸氫鈉。 RT RPMI 1640 Medium ① 0684100g 。用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。 0687500g ( for 1L) Nissui 不含L谷氨酸、碳酸氫鈉。該培養(yǎng)基能克服一般RPMI 1640 培養(yǎng)基只能膜過濾除菌而難以除去諸如支原體的缺點(diǎn)，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠和人的白血病細(xì)胞、各種細(xì)胞系和KATOIII細(xì)胞株能顯著增強(qiáng)它們的活性。由于是無血清配方，減少了牛血清各批次間成分不同而對試驗的干擾。 RT UC Medium 202 05923103g ( for 1L) Nissui 不含碳酸氫鈉。該培養(yǎng)基加入1％胎牛血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞的效果等同于αMEM加入5％胎牛血清。特別適用于HeLa、L或其他細(xì)胞系的培養(yǎng)。用于懸浮培養(yǎng)。SFM101是一種無血培養(yǎng)基，對細(xì)胞培養(yǎng)和幫助小鼠雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)抗體作用顯著。低蛋白含量，使得后期對細(xì)胞產(chǎn)物如單克隆抗體和生物活性物質(zhì)的收集和純化更加便利。 RT Earle’s Solution 05907100g ( for 1L) Nissui 不含碳酸氫鈉。 RT Hanks’ Solution ② 05906100