細(xì)胞工程-動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)與原理-在線瀏覽
2025-02-26 16:46本頁面
【正文】 治療性抗體 抗體藥物 動(dòng)物克隆技術(shù)的應(yīng)用前景： （ 1）保存優(yōu)良的動(dòng)物品種 （ 2）拯救瀕臨滅絕的珍惜動(dòng)物 （ 3）利用克隆動(dòng)物工廠生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物 （ 4）利用克隆技術(shù)生產(chǎn)人體器官 二、動(dòng)物細(xì)胞特性 動(dòng)物細(xì)胞在活體內(nèi)的特性 培養(yǎng)條件下動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性 培養(yǎng)條件下動(dòng)物細(xì)胞生理特性 1. 動(dòng)物細(xì)胞在活體內(nèi)的特性 在活體內(nèi)，動(dòng)物細(xì)胞 : 分化的動(dòng)物細(xì)胞在功能上具有明確的分工，并具有明顯的形態(tài)學(xué)特征。 增殖 分化 活體內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞按照分裂能力可以分為三大類： 第一類是能保持繼續(xù)分裂能力的細(xì)胞，可以繼續(xù)不斷地分裂，如骨髓干細(xì)胞、各類前體細(xì)胞； 第二類細(xì)胞群是永久失去分裂能力的細(xì)胞，如各類高度特化的細(xì)胞； 第三類是靜止細(xì)胞群，即所謂的G0細(xì)胞，在正常情況下，它們不分裂，也不合成 DNA，但在受到刺激后，則重新進(jìn)入細(xì)胞分裂。 第一類和第三類細(xì)胞在適當(dāng)條件下可進(jìn)行離體培養(yǎng)。 成纖維細(xì)胞型 細(xì)胞形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，胞內(nèi)呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有園形核，胞質(zhì)向外伸出 2～ 3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起。除真正的成纖維細(xì)胞外，心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)均屬這一類型。在 一定條件下，可轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞 型。 nerve cell 2）非貼壁依賴型 也稱懸浮型，這類細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不貼附于支持物上，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。 3）兼性貼壁細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，有些細(xì)胞呈現(xiàn)雙重性，既可以貼壁生長(zhǎng)，也可以懸浮培養(yǎng)，如中國地鼠卵巢細(xì)胞、小鼠 L929細(xì)胞等。此外，培養(yǎng)條件如溫度、pH、培養(yǎng)基的成分等，也會(huì)影響分裂周期的長(zhǎng)短。當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片即每個(gè)細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時(shí)，細(xì)胞就停止增殖，即細(xì)胞密度不再增加，這一現(xiàn)象稱之為接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。有限細(xì)胞系即使培養(yǎng)條件均能滿足細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)，它們也只能在有限的時(shí)間內(nèi)生存，一般經(jīng)過 30~50世代后細(xì)胞將逐漸死亡。年齡越大繼代次數(shù)越少。 大多數(shù)細(xì)胞系在有限的代數(shù)內(nèi)以不變的形式增殖，當(dāng)超過有限世代后，它們可能有兩種情況：一是衰老死亡，二是發(fā)育成 永久細(xì)胞系 或稱連續(xù)細(xì)胞系。 永久細(xì)胞系有如下特征： 細(xì)胞形態(tài)變化，如細(xì)胞變小，黏附性減少，具有較高的核質(zhì)比； 生長(zhǎng)速率增加，倍增時(shí)間縮短；對(duì)血清的依賴性減小； 貼壁依賴性降低；細(xì)胞異倍體和非整倍體增加，細(xì)胞接種到體內(nèi)后，生癌率上升。 4）動(dòng)物細(xì)胞的環(huán)境敏感性 動(dòng)物細(xì)胞與微生物和植物細(xì)胞相比，其培養(yǎng)難度要大一些，其主要原因是動(dòng)物細(xì)胞只有細(xì)胞膜，而沒有細(xì)胞壁的保護(hù)。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求也十分復(fù)雜。 總體上講，動(dòng)物細(xì)胞忍受低溫的能力比忍受高溫的能力強(qiáng)。液氮凍存。 培養(yǎng)細(xì)胞對(duì) pH的要求因培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，一般原代細(xì)胞要求較嚴(yán)格，而永久細(xì)胞系對(duì) pH具有較強(qiáng)的忍耐性。 除了氧氣供應(yīng)外，還應(yīng)注意培養(yǎng)基的氧氣和 CO2的平衡。動(dòng)物細(xì)胞滲透壓的維持一般采用平衡鹽溶液。 原代（初代）培養(yǎng) ：指將機(jī)體取出的組織或細(xì)胞進(jìn)行初次培養(yǎng)的過程。 傳代（繼代）培養(yǎng) ：從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。 二、取材、分離和組織消化 (to draw the materials from tissue， separation ， digestion ) （一）取材 ——獲取組織 原則上各種動(dòng)物組織都可進(jìn)行體外培養(yǎng)，而實(shí)際上幼齡組織（尤其 是胚胎組織）比老齡組織容易培養(yǎng)、分化程度低的比分化程度高的 容易培養(yǎng)、腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。 取材方法 : 處死動(dòng)物 → 取出組織塊，放入小燒杯中 → 用尖嘴眼科剪刀 將組織塊剪碎（ 1mm3），用吸管吸取 Hanks液沖下剪刀上的碎 塊，補(bǔ)加 3~5ml Hanks液，用吸管輕輕吹打； → 低速離心，棄去上 清液，留下組織塊。 （二）組織消化 (tissue digestion) 用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。 （ 2） 膠原酶： 適用于纖維組織、上皮組織、癌組織等。 組織消化操作方法 (tissue digestion method of operation) （ 1）胰蛋白酶消化 (trypsin digestion) ① 將剪碎的組織塊放入有玻璃珠的三角燒瓶中，加入 30~50倍體積的 %胰 蛋白酶； ② 37℃ 水浴內(nèi)消化 30~60min，每 5~10min搖動(dòng)一次。（靜止 10min，吸去 2/3上清液，補(bǔ)加新鮮胰蛋白酶） ③ Hanks液漂洗兩次，每次 2~3min； ④ 800r/min離心 5min，棄上清液，加入營(yíng)養(yǎng)液。 如消化傳代細(xì)胞，可與 EDTA混用。期間可更換酶液一次； ③見組織塊已變軟，分散于瓶底時(shí)，輕微震蕩使散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。 三、細(xì)胞計(jì)數(shù) (cell counting) ——計(jì)數(shù)懸浮液中細(xì)胞的形態(tài)及濃度，以判斷消化或稀釋程度（亦用于培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度的檢查） ① 染色 ：在干凈的離心管中加入 9滴細(xì)胞懸液，再加入 1滴 %臺(tái)盼藍(lán)，混勻，靜置 2~3min； ② 充池 ：在計(jì)數(shù)板蓋片邊緣加入 1~2滴染色的細(xì)胞懸液，使之完全充
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1