細胞工程-動物細胞培養(yǎng)基本技術(shù)與原理(文件)
【正文】 出培養(yǎng)液，用 G6濾器過濾貯于冰箱中備用。 ②選擇細胞克隆時，應(yīng)逐日觀察，能證明被選留的細胞群確系來自于單個細胞。 （ 3）多孔塑料板分離法（ foamed plastics Separation） 將 1ml含有 7~8個細胞的懸液接種到多孔無毒塑料板中，每一塊板上有數(shù)十個圓形小穴。 胚胎組織 ——次日可見生長， 1周內(nèi)即連接成片。 ⑵ 吸附期 ：與細胞種類、培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。 ⑶ 繁殖期 （ idiophase） 細胞由圓形變成延展細胞，進而過渡成極性細胞；繼之出現(xiàn)細胞 分裂，細胞數(shù)目不斷增多；同時有一定的移動現(xiàn)象。 培養(yǎng)液 pH 正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。 ⑴霉菌：培養(yǎng)基中出現(xiàn)相應(yīng)的菌落。 預(yù)防方法：嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。注意時間過長，活細胞亦可受損而著色。注意藻紅 B易同蛋白質(zhì)結(jié)合，須把血清洗凈。 * 細胞的復(fù)蘇：慢凍快融， 迅速投入 37℃ 水浴中 演講完畢，謝謝觀看！ 。 七、動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)（ zooblast mass culture） 培養(yǎng)方式 反應(yīng)物 營養(yǎng)液 評價 分批式培養(yǎng) 一次性取出 一次性加入 后期細胞生長不良 根據(jù)細胞生長 流加式培養(yǎng) 一次性取出 情況及時補充 細胞生長環(huán)境平穩(wěn) 反饋控制流加 無反饋控制流加 經(jīng)一段時間分 取出反應(yīng)物同時 適用于微載體 半連續(xù)培養(yǎng) 批式培養(yǎng)，取 補充等量新的營 培養(yǎng)系統(tǒng) 出部分反應(yīng)物 養(yǎng)液 保持細胞優(yōu)化狀態(tài)， 有利于細胞、產(chǎn)物 連續(xù)培養(yǎng) 不斷地取出 不斷地加入 的連續(xù)生產(chǎn)和細胞 （灌注培養(yǎng)） 生理、代謝規(guī)律的研究 八、細胞的凍存與復(fù)蘇技術(shù) (cell freeze resuscitation technique) 細胞的凍存 * 細胞系和細胞株的保存：超低溫冰箱、液氮罐冷凍保護劑的作用：結(jié)合細胞中水分子，降溫時減少細胞內(nèi)冰晶分子的形成，以免對細胞造成傷害。注意苯胺黑溶解性較差，用前應(yīng)先過濾。 細胞活性 (cytoactive) 原理：細胞對色素的吸附性 方法：常用的是染色排除法，即 死細胞著色法 ⑴臺盼藍染色： ，溶于 100ml Hanks液， 調(diào) pH至 ~。 ⑶支原體污染： 經(jīng)常發(fā)生而難以發(fā)現(xiàn)。 微生物污染 (microbial contamination) 常見來源：培養(yǎng)液、培養(yǎng)塞、血清、操作時空氣污染。 細胞形態(tài)（ cellular shape） 生長良好細胞：倒置顯微鏡下觀察透明度大，輪廓不清。細胞機能狀態(tài)不良或瀕死細胞不貼壁 培養(yǎng)基偏酸或偏堿、污染、膠基有毒、培養(yǎng)瓶洗刷不潔等均不利于細胞貼壁。 ⑴ 游離期 細胞呈懸浮狀態(tài)。 六、細胞的常規(guī)檢查（ corpuscular routine examination） 檢查內(nèi)容：細胞的生長狀態(tài)、培養(yǎng)液 pH 、污染、細胞活力。 （ 2）瓊脂分離法 （ agar Separation） 瓊脂培養(yǎng)基的制備： 選擇質(zhì)量好的瓊脂，用三蒸水配成 3%的溶液，分裝，滅菌。 細胞株的制備方法（ 3種）： （ 1）集落形成分離法 平皿中接種稀釋細胞 細胞貼壁 繁殖成許多小群 選擇一個最好的細胞群做標(biāo)記 機械法刮除所有其他細胞群 培養(yǎng)保留下來的細胞群 . 克隆成功的關(guān)鍵： ①接種細胞數(shù)量要合適、細胞要分散得好。 單個細胞的生活能力很弱，必須采取特殊的培養(yǎng)措施 適應(yīng)和同化過程 ：在細胞接種到新培養(yǎng)液的初期，細胞既從培養(yǎng)液 中攝取營養(yǎng)，也要向培養(yǎng)液排出一定物質(zhì)，其結(jié)果使得培養(yǎng)液更易 被吸收和利用。 五、細胞系與克隆株（ cell line and clone） 細胞系的建立 原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細胞類型多而復(fù)雜，培養(yǎng)初期，生長的 細胞類型多種多樣隨培養(yǎng)時間延長：一些細胞退化、死亡；另一些 細胞適應(yīng)環(huán)境而生長繁殖培養(yǎng)物逐步變均勻。 （五）微載體培養(yǎng)法 (microcarrier culture) 載體 ： DEAE交聯(lián)葡聚糖微粒、 DEAE纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、無機玻璃基質(zhì)微載體等 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細胞步驟： 選擇合適的微載體類型 ——獲得最大量的細胞，以微載體能全部懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)為最好 浸泡水化及消毒 用無
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