細(xì)胞工程-動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)與原理(文件)
【正文】 出培養(yǎng)液，用 G6濾器過(guò)濾貯于冰箱中備用。 ②選擇細(xì)胞克隆時(shí)，應(yīng)逐日觀察，能證明被選留的細(xì)胞群確系來(lái)自于單個(gè)細(xì)胞。 （ 3）多孔塑料板分離法（ foamed plastics Separation） 將 1ml含有 7~8個(gè)細(xì)胞的懸液接種到多孔無(wú)毒塑料板中，每一塊板上有數(shù)十個(gè)圓形小穴。 胚胎組織 ——次日可見(jiàn)生長(zhǎng)， 1周內(nèi)即連接成片。 ⑵ 吸附期 ：與細(xì)胞種類、培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。 ⑶ 繁殖期 （ idiophase） 細(xì)胞由圓形變成延展細(xì)胞，進(jìn)而過(guò)渡成極性細(xì)胞；繼之出現(xiàn)細(xì)胞 分裂，細(xì)胞數(shù)目不斷增多；同時(shí)有一定的移動(dòng)現(xiàn)象。 培養(yǎng)液 pH 正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。 ⑴霉菌：培養(yǎng)基中出現(xiàn)相應(yīng)的菌落。 預(yù)防方法：嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。注意時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，活細(xì)胞亦可受損而著色。注意藻紅 B易同蛋白質(zhì)結(jié)合，須把血清洗凈。 * 細(xì)胞的復(fù)蘇：慢凍快融， 迅速投入 37℃ 水浴中 演講完畢，謝謝觀看！ 。 七、動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（ zooblast mass culture） 培養(yǎng)方式 反應(yīng)物 營(yíng)養(yǎng)液 評(píng)價(jià) 分批式培養(yǎng) 一次性取出 一次性加入 后期細(xì)胞生長(zhǎng)不良 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng) 流加式培養(yǎng) 一次性取出 情況及時(shí)補(bǔ)充 細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境平穩(wěn) 反饋控制流加 無(wú)反饋控制流加 經(jīng)一段時(shí)間分 取出反應(yīng)物同時(shí) 適用于微載體 半連續(xù)培養(yǎng) 批式培養(yǎng)，取 補(bǔ)充等量新的營(yíng) 培養(yǎng)系統(tǒng) 出部分反應(yīng)物 養(yǎng)液 保持細(xì)胞優(yōu)化狀態(tài)， 有利于細(xì)胞、產(chǎn)物 連續(xù)培養(yǎng) 不斷地取出 不斷地加入 的連續(xù)生產(chǎn)和細(xì)胞 （灌注培養(yǎng)） 生理、代謝規(guī)律的研究 八、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇技術(shù) (cell freeze resuscitation technique) 細(xì)胞的凍存 * 細(xì)胞系和細(xì)胞株的保存：超低溫冰箱、液氮罐冷凍保護(hù)劑的作用：結(jié)合細(xì)胞中水分子，降溫時(shí)減少細(xì)胞內(nèi)冰晶分子的形成，以免對(duì)細(xì)胞造成傷害。注意苯胺黑溶解性較差，用前應(yīng)先過(guò)濾。 細(xì)胞活性 (cytoactive) 原理：細(xì)胞對(duì)色素的吸附性 方法：常用的是染色排除法，即 死細(xì)胞著色法 ⑴臺(tái)盼藍(lán)染色： ，溶于 100ml Hanks液， 調(diào) pH至 ~。 ⑶支原體污染： 經(jīng)常發(fā)生而難以發(fā)現(xiàn)。 微生物污染 (microbial contamination) 常見(jiàn)來(lái)源：培養(yǎng)液、培養(yǎng)塞、血清、操作時(shí)空氣污染。 細(xì)胞形態(tài)（ cellular shape） 生長(zhǎng)良好細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察透明度大，輪廓不清。細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)不良或?yàn)l死細(xì)胞不貼壁 培養(yǎng)基偏酸或偏堿、污染、膠基有毒、培養(yǎng)瓶洗刷不潔等均不利于細(xì)胞貼壁。 ⑴ 游離期 細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。 六、細(xì)胞的常規(guī)檢查（ corpuscular routine examination） 檢查內(nèi)容：細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、培養(yǎng)液 pH 、污染、細(xì)胞活力。 （ 2）瓊脂分離法 （ agar Separation） 瓊脂培養(yǎng)基的制備： 選擇質(zhì)量好的瓊脂，用三蒸水配成 3%的溶液，分裝，滅菌。 細(xì)胞株的制備方法（ 3種）： （ 1）集落形成分離法 平皿中接種稀釋細(xì)胞 細(xì)胞貼壁 繁殖成許多小群 選擇一個(gè)最好的細(xì)胞群做標(biāo)記 機(jī)械法刮除所有其他細(xì)胞群 培養(yǎng)保留下來(lái)的細(xì)胞群 . 克隆成功的關(guān)鍵： ①接種細(xì)胞數(shù)量要合適、細(xì)胞要分散得好。 單個(gè)細(xì)胞的生活能力很弱，必須采取特殊的培養(yǎng)措施 適應(yīng)和同化過(guò)程 ：在細(xì)胞接種到新培養(yǎng)液的初期，細(xì)胞既從培養(yǎng)液 中攝取營(yíng)養(yǎng)，也要向培養(yǎng)液排出一定物質(zhì)，其結(jié)果使得培養(yǎng)液更易 被吸收和利用。 五、細(xì)胞系與克隆株（ cell line and clone） 細(xì)胞系的建立 原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細(xì)胞類型多而復(fù)雜，培養(yǎng)初期，生長(zhǎng)的 細(xì)胞類型多種多樣隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)：一些細(xì)胞退化、死亡；另一些 細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境而生長(zhǎng)繁殖培養(yǎng)物逐步變均勻。 （五）微載體培養(yǎng)法 (microcarrier culture) 載體 ： DEAE交聯(lián)葡聚糖微粒、 DEAE纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、無(wú)機(jī)玻璃基質(zhì)微載體等 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞步驟： 選擇合適的微載體類型 ——獲得最大量的細(xì)胞，以微載體能全部懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)為最好 浸泡水化及消毒 用無(wú)
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