《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)hxy》ppt課件(文件)
【正文】 于 生長(zhǎng)受到影響， 甚至死亡。 48 細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù) ? 定義 ? 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) ：就是將動(dòng)物組織或細(xì)胞從機(jī)體中取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長(zhǎng)條件，模擬體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長(zhǎng)和增殖的技術(shù)。 ③ 對(duì)培養(yǎng)環(huán)境極其敏感，包括 pH、溶解氧、溫度、剪切力等都需嚴(yán)格監(jiān)控。 ? 原代細(xì)胞通常由多種細(xì)胞組成（異質(zhì)性），細(xì)胞獨(dú)立生存性差 53 過(guò)程 組織 取材 組織細(xì)胞的 分離 培養(yǎng) 機(jī)械法 消化法 動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官 細(xì)胞懸液 胰蛋白酶 1代細(xì)胞 原代培養(yǎng) 50代細(xì)胞 傳代培養(yǎng) 無(wú)限傳代 單個(gè)細(xì)胞 加培養(yǎng)液 動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。加肝素 抗凝劑防止凝血。 ? 切割分離法： 用剪刀剪切成 1mm3左右的小塊。使用濃度一般為%%，用不含鈣、鎂離子的 BSS配制，PH89?？捎煤}、鎂離子的 BSS配制或溶于含血清的培養(yǎng)液中?？捎貌缓}、鎂離子的 BSS配制成 %溶液。少數(shù)動(dòng)物細(xì)胞（血液和淋巴組織細(xì)胞等非貼壁動(dòng)物細(xì)胞）可懸浮生長(zhǎng)，采集組織分散、過(guò)濾、離心、純化、漂洗后接種培養(yǎng)。 ? 貼壁培養(yǎng)： 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞需貼附于帶適量正電荷的固體或半固體表面進(jìn)行培養(yǎng)。 3. 25min檢查，如有細(xì)胞間隙變大，加入蛋白酶抑制劑或血清培養(yǎng)液終止消化。 ? 2. 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代 ? 消化法或直接吹打法 ? 3. 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 ? 離心法：培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到離心管， 1000r/min離心 。 ? 優(yōu)點(diǎn)： 1）容易換片。采用的材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，透明 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶 滾動(dòng)培養(yǎng)瓶 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶 ?蓋玻片 +培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 ：先以蓋玻片為生長(zhǎng)表面，將擬培養(yǎng)細(xì)胞或組織接種于蓋玻片上，然后放進(jìn)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。 缺點(diǎn) ：不易在顯微鏡下觀察?？纱龠M(jìn)與支持其他種細(xì)胞的生長(zhǎng)。 篩選同步化細(xì)胞 誘導(dǎo)同步化細(xì)胞 M期細(xì)胞震蕩脫落法 離心洗脫法 梯度沉降法 血清饑餓法 異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺乏法 DNA合成抑制劑阻斷法 秋水仙素阻斷法 1. 分批式操作 2. 流加式操作 3. 半連續(xù)式操作 4. 連續(xù)式操作 5. 灌流式操作 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，污染和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。 缺點(diǎn)：開放式操作，容易造成污染。分為有限細(xì)胞系、無(wú)限細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞能長(zhǎng)期被利用，一般在初代或 2～ 5代即大量?jī)龃孀鳛樵N。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性 和 異體接種致瘤性 。 （ 4）使用高濃度血清（ 30%） （ 5）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑（ DMSO、甘油） 細(xì)胞冷凍保存液主要成分：低溫保護(hù)劑 (甘油或DMSO,510%)，培養(yǎng)基（ 70%），血清（ 20%）。 2. 將 1－ 2ml 凍存細(xì)胞液加入到 25ml 新鮮完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液中，輕輕混勻。 2448h 后換液。 4. 用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞。要帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，放入 37℃ 水浴中。 細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用 ATCC入庫(kù)細(xì)胞要求檢測(cè)項(xiàng)目如下： 培養(yǎng)簡(jiǎn)歷： 組織來(lái)源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等 凍 存 液： 培養(yǎng)基和防凍液名稱 細(xì)胞活力： 融解前后細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性 培 養(yǎng) 液： 培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來(lái)源和含量 細(xì)胞形態(tài)： 類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性 核 型： 二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無(wú) 無(wú)污染檢測(cè)： 包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等 物種檢測(cè)： 檢測(cè)同工酶，以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè) 免疫檢測(cè)： 一兩種血清學(xué)檢測(cè) 細(xì)胞建立者： 建立者姓名；檢測(cè)者姓名 細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸 92 細(xì)胞的凍存 主要目的： （ 1）保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用 （ 2）降低人力和物力 （ 3）減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性 （ 4）避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)變 （ 5）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變 冷凍保存要點(diǎn) （ 1）冷凍過(guò)程要緩慢，有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘 1 到 3℃ 速度降溫，一直到 80℃以下，然后直接放入液氮中長(zhǎng)期保存 （ 2）凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于 90％，無(wú)微生物污染。這類細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。 ? 二倍體細(xì)胞： 細(xì)胞群染色體數(shù)目與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（ 2n細(xì)胞占 75％或 80％以上）的細(xì)胞群。 優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)狀
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