動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)hxyppt課件(已改無(wú)錯(cuò)字)
2023-06-04 22:01:39 本頁(yè)面
【正文】 酶是由細(xì)菌中提取出的酶，適用于消化纖維組織、上皮組織或膠原成分的組織?？捎煤}、鎂離子的 BSS配制或溶于含血清的培養(yǎng)液中。使用濃度一般為 ， 37℃ 溫育。 ? 優(yōu)點(diǎn)：消化緩和、無(wú)需機(jī)械振蕩 ? 缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴 ? 可與胰蛋白酶混用 64 ③其他消化酶消化法 ：鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等。 ④螯合劑消化法： 常用螯合劑有檸檬酸鈉、 EDTANa2等?？捎貌缓}、鎂離子的 BSS配制成 %溶液。EDTA適于消化傳代細(xì)胞，不受血清抑制，消化后需徹底清洗。 65 ? （三）培養(yǎng)方法 ? ：簡(jiǎn)便，成功率較低 ? :將解離得到的細(xì)胞用培養(yǎng)液配制成一定密度的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)。 ? ： 指細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)增殖的培養(yǎng)方法。少數(shù)動(dòng)物細(xì)胞（血液和淋巴組織細(xì)胞等非貼壁動(dòng)物細(xì)胞）可懸浮生長(zhǎng)，采集組織分散、過(guò)濾、離心、純化、漂洗后接種培養(yǎng)。 ? 傳代培養(yǎng) ? 傳代培養(yǎng)： 從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。 ? 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)類型 : ? 非貼壁培養(yǎng)： 也叫懸浮培養(yǎng)。用于血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等的培養(yǎng)，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。 ? 貼壁培養(yǎng)： 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞需貼附于帶適量正電荷的固體或半固體表面進(jìn)行培養(yǎng)。 67 68 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代（消化法） ： 要求細(xì)胞覆蓋 80%以上 1. 吸出舊的培養(yǎng)液。用不含鈣、鎂離子的 BSS溶液清洗。 2. 加入 %胰蛋白酶和 %EDTA混合液解離細(xì)胞。 3. 25min檢查，如有細(xì)胞間隙變大，加入蛋白酶抑制劑或血清培養(yǎng)液終止消化。 4. 離心，棄上清液，加入 Hanks液漂洗兩次。 5. 吸管輕輕吹打，加入新鮮培養(yǎng)液，制成懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整其密度。 6. 重新接種培養(yǎng)。 ? 2. 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代 ? 消化法或直接吹打法 ? 3. 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 ? 離心法：培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到離心管， 1000r/min離心 。棄上清液，沉淀細(xì)胞加新培養(yǎng)液混勻傳代。 ? 常用培養(yǎng)技術(shù) ? ： 又稱植塊懸滴培養(yǎng)法， 1907年由哈里森首創(chuàng)。即將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營(yíng)養(yǎng)液懸掛于蓋玻片下，再臵于一凹形載玻片上，最后用熔蠟密封后放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ? 優(yōu)點(diǎn)： 1）容易換片。 ? 2）培養(yǎng)物在培養(yǎng)過(guò)程中，不需移動(dòng)位臵，有利于組織分化。 72 ： 指將培養(yǎng)對(duì)象直接接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。 ? 1923年，卡雷爾（ Carrel）設(shè)計(jì)了卡氏瓶。采用的材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，透明 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶 滾動(dòng)培養(yǎng)瓶 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶 ?蓋玻片 +培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 ：先以蓋玻片為生長(zhǎng)表面，將擬培養(yǎng)細(xì)胞或組織接種于蓋玻片上，然后放進(jìn)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。 ? 優(yōu)點(diǎn) ： 1）可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響 2）可以方便顯微觀察、染色等操作，以及永久保存 3）增加了培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面積。 ： 蓋爾（ Gey， 1933年）、劉易斯（Lewis， 1934年）建立該方法。 特點(diǎn) ：是培養(yǎng)中組織塊或細(xì)胞交替地與培養(yǎng)液和空氣直接接觸，有利于物質(zhì)交換和細(xì)胞生長(zhǎng)。 缺點(diǎn) ：不易在顯微鏡下觀察。 77 78 ：又稱單細(xì)胞分離培養(yǎng)法， 就是將細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新繁殖成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。 細(xì)胞株 :由 細(xì)胞系 進(jìn)一步克隆化，而獲得的由 單一細(xì)胞 形成的細(xì)胞群體。 初代細(xì)胞和有限細(xì)胞系的克隆培養(yǎng)比較困難， 無(wú)限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞等則比較容易 ? 提高克隆形成率的措施： – 合理安排接種的密度（＜ 10個(gè)細(xì)胞 /ml） – 使用克隆培養(yǎng)基（ Ham12K培養(yǎng)液） – 使用同源細(xì)胞的 條件培養(yǎng)液 – 在培養(yǎng)中加入胎牛血清或其他添加劑、激素和生長(zhǎng)因子 – 將祖細(xì)胞接種到 飼養(yǎng)細(xì)胞 層或其他可適應(yīng)的生長(zhǎng)基質(zhì)表面 79 ? 條件培養(yǎng)液 ：已經(jīng)培養(yǎng)過(guò)某種細(xì)胞的培養(yǎng)液（內(nèi)含該細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)，包括少量生長(zhǎng)因子）與一定比例新鮮培養(yǎng)液混合的培養(yǎng)液。可促進(jìn)與支持其他種細(xì)胞的生長(zhǎng)。 ? 飼養(yǎng)細(xì)胞 ：也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過(guò)射線照射或裂霉素 C作用后失去分裂能力，供其他細(xì)胞附著的細(xì)胞層。能促進(jìn)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，利于克隆的形成。 80 ? 克隆培養(yǎng)技術(shù)： ? ? ? ? ? 81 82 ：用自然的或人工的方法獲得細(xì)胞周期同步化的細(xì)胞群體。 篩選同步化細(xì)胞 誘導(dǎo)同步化細(xì)胞 M期細(xì)胞震蕩脫落法 離心洗脫法 梯度沉降法 血清饑餓法 異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺乏法 DNA合成抑制劑阻斷法 秋水仙素阻斷法 1. 分批式操作 2. 流加式操作 3. 半連
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