動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)hxyppt課件(編輯修改稿)
2025-05-31 22:01 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ? （ 3）無機(jī)離子：包括大量和微量無機(jī)離子，通常也可由血清提供。 ? （ 4）碳源：以葡萄糖為主。 ? （ 5）其他：嘌呤、嘧啶、輔酶及抗氧化劑等。 41 ? 動(dòng)物血清成分復(fù)雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未 明確 ，后期對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測(cè)會(huì)造成一定困難。另外高質(zhì)量的動(dòng)物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。 42 ? 無血清培養(yǎng)基不加動(dòng)物血清，一般由 基礎(chǔ)培養(yǎng) 液 和 替代血清的 添加 成分 （細(xì)胞生長有效因子，激素等）兩部分組成。 ? 可保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。但成本較高，針對(duì)性較強(qiáng)，一種無血清培養(yǎng)基只適用于某一類細(xì)胞的培養(yǎng)。 ? 主要用于：研究細(xì)胞生長因子、單克隆抗體的制備、以及細(xì)胞分泌產(chǎn)物研究 43 ? （ 1）基礎(chǔ)培養(yǎng) 液 ? 根據(jù)不同培養(yǎng)細(xì)胞選擇合適的合成培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。常用 DMEM和 F12以 1： 1比例混合作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用 NaHCO3或 HEPES溶液調(diào)整pH。 44 （ 2）補(bǔ)充成分 ① 激素和生長因子 ：激素有胰島素、生長激素和多種生長因子如表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、增殖刺激因子、類胰島素生長因子等。主要是刺激生長，維持細(xì)胞功能的作用。 ② 結(jié)合蛋白 和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ：主要是轉(zhuǎn)鐵蛋白（增強(qiáng)細(xì)胞攝取培養(yǎng)基中鐵的能力，可螯合痕量有害金屬離子）和白蛋白（參與運(yùn)載一些脂類、金屬離子等，也有螯合過量微量元素的作用）兩種蛋白。 45 ③ 貼壁和鋪展因子 ：幫助細(xì)胞貼壁和鋪展。如纖黏蛋白、血清鋪展因子、膠原等。 ④ 微量元素和低分子量營養(yǎng)因子 ：硒元素、丁二胺、亞油酸等。 ⑤ 酶抑制劑 ：常用大豆胰酶抑制劑。 46 47 影響動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的因素 ? （ 1）溫度 ： 哺乳動(dòng)物最適溫度 177。 ℃ ；對(duì)低溫耐受性比高溫強(qiáng)。 ? （ 2） pH： ～ 。低于 生長受到影響， 甚至死亡。 偏酸性耐受較強(qiáng)，偏堿性很快死亡。 ? （ 3）氣體 ： O2； CO2，還可調(diào)節(jié) pH。 ? （ 4）滲透壓 ： 不同細(xì)胞要求不同。 48 細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù) ? 定義 ? 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) ：就是將動(dòng)物組織或細(xì)胞從機(jī)體中取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)的生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長和增殖的技術(shù)。 ? 體外培養(yǎng)可分為 原代培養(yǎng) 和 傳代培養(yǎng) 。 49 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的特點(diǎn) : ① 大多數(shù)須附著在固體或半固體的表面才能生長。 ② 對(duì)于營養(yǎng)要求苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需要血清。 ③ 對(duì)培養(yǎng)環(huán)境極其敏感，包括 pH、溶解氧、溫度、剪切力等都需嚴(yán)格監(jiān)控。 ④ 生長緩慢，培養(yǎng)時(shí)間長，培養(yǎng)代價(jià)大 ⑤ 污染問題難以控制。 ? 原代培養(yǎng) ? 原代培養(yǎng)： 從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。 ? 特點(diǎn)： 原代細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生大變化，仍具有二倍體遺傳特性，最接近和反應(yīng)生物體內(nèi)生長特性， 是藥物檢測(cè)、細(xì)胞分化的很好實(shí)驗(yàn)工具。 ? 原代細(xì)胞通常由多種細(xì)胞組成（異質(zhì)性），細(xì)胞獨(dú)立生存性差 53 過程 組織 取材 組織細(xì)胞的 分離 培養(yǎng) 機(jī)械法 消化法 動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官 細(xì)胞懸液 胰蛋白酶 1代細(xì)胞 原代培養(yǎng) 50代細(xì)胞 傳代培養(yǎng) 無限傳代 單個(gè)細(xì)胞 加培養(yǎng)液 動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。 （分解彈性纖維） ? （一）組織取材 ? 1. 雞胚組織：用于病毒與疫苗研究 56 ? 2. 鼠胚組織：與人最相近的哺乳動(dòng)物組織，取材方便，易于培養(yǎng)。 57 ⑥ ① ② ③ ④ ⑤ 機(jī)械法分離胚胎 ? 3. 皮膚和粘膜：多來源于手術(shù)，需嚴(yán)格消毒以消滅細(xì)菌霉菌。 ? 4. 血細(xì)胞：靜脈取血、指尖或耳垂取血。加肝素 抗凝劑防止凝血。 ? 5. 內(nèi)臟和實(shí)體瘤：主要源于外科手術(shù)和活檢組織。 59 60 ? （二）組織細(xì)胞的分離 ? 有 機(jī)械法 和 消化法 兩大類 ? ： ? 離心分離法： 適用于細(xì)胞懸液組織。 5001000rpm離心 510min。 ? 切割分離法： 用剪刀剪切成 1mm3左右的小塊。 ? 機(jī)械分散法： 擠壓和研磨，適用于纖維含量少的組織。 61 ? （二）組織細(xì)胞的分離 ? ：可使組織疏松，細(xì)胞分開，細(xì)胞容易生長，成活率高。 ? ①胰蛋白酶消化法： 適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，對(duì)傳代細(xì)胞也適用。使用濃度一般為%%，用不含鈣、鎂離子的 BSS配制，PH89。血清有抑制其活性作用。 ? 胰蛋白酶消化法有熱 (37℃) 和冷 (4 ℃) 兩種處理。 63 ? ②膠原酶消化法： 膠原
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