【文章內(nèi)容簡介】 質(zhì)等聚合程度高的化合物 。 只能利用簡單的單體化合物如單糖 、 氨基酸等 ， 為了維持細(xì)胞正常生長 ， 還必須添加維生素 、 無機(jī)鹽類 、生長類因子及激素 、 結(jié)合蛋白質(zhì) 、 貼附與伸展因子及其它附加成分等 。 動物細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境的要求高 ， 不同細(xì)胞系的要求也不盡相同 ， 培養(yǎng)基要盡可能與體內(nèi)生活條件接近 。 一 、 動物細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求 糖類是細(xì)胞主要的營養(yǎng)物質(zhì) ， 分解后釋放出能量 ATP。 培養(yǎng)基中都必須添加葡萄糖 ， 有時添加核糖等 。 提高細(xì)胞生長的碳源和能源 ， 主要是葡萄糖和谷氨酰胺 。 2. 氨基酸 氨基酸是蛋白質(zhì)和酶的組成單位 。 氨基酸還參與合成一些含氮化合物 ， 核苷酸的四種嘌呤和嘧啶堿基 、 兒茶酚胺等含氮激素及神經(jīng)遞質(zhì)等 。 氨基酸可通過生糖或生酮途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑舅?， 間接提供能量 。 動物細(xì)胞： 8－ 10種必須氨基酸 。 離體容易失去 ， 20種氨基酸中至少 12種是必需氨基酸： 精氨酸 、 半胱氨酸 、 組氨酸 、 異亮氨酸 、 亮氨酸 、 賴氨酸 、蛋氨酸 、 苯丙氨酸 、 蘇氨酸 、 色氨酸 、 酪氨酸 、 纈氨酸等 。 谷氨酰胺還可作為重要的碳源和能源而被利用 。 3. 維生素 維生素是一類微量的小分子有機(jī)生物活性物質(zhì) ， 對代謝和生長起調(diào)節(jié)和控制作用 。 水溶性維生素包括 B族維生素和維生素 C。 B族維生素以輔酶或輔基形式參與酶反應(yīng) ， 主要調(diào)節(jié)酶活性和代謝活性 。維生素 C， 抗壞血酸 ， 在體內(nèi)參與還原反應(yīng) 、 羥化反應(yīng) ，促進(jìn)膠原蛋白合成和粘多糖合成 ， 抗氧化作用 。 脂溶性維生素包括維生素 A、 D、 E、 K四種 。 維生素 A維持正常視覺和上皮組織 。 維生素 D為視固醇類化合物 ， 主要是調(diào)節(jié)鈣磷代謝 。 維生素 E即生育酚 ， 是抗氧化劑 ， 防止生物膜中磷脂的不飽和脂肪酸被氧化 。 維生素 K， 促進(jìn)合成凝血酶原 ， 促進(jìn)血液凝固 。 5. 無機(jī)鹽類 無機(jī)鹽是細(xì)胞代謝所需的酶的輔基 ， 同時保持細(xì)胞的滲透壓和緩沖 pH的變化 。 Na＋ 和 Cl－ 參與生理電活動 ， 維持水平衡 、 保持滲透壓和酸堿平衡 。 離體培養(yǎng)為細(xì)胞提供足夠的 Na和 Cl離子是基本條件 ， 一般生理鹽水的離子濃度 （ % NaCl） 。 Ca2＋ 、 Mg2＋ ， 對細(xì)胞間的互黏穩(wěn)定起重要作用 。 在離體培養(yǎng)時 ， 螯合細(xì)胞間的 Ca2＋ 和 Mg2＋ ， 可以達(dá)到分散細(xì)胞的目的 。 磷是核酸 、 磷脂等的組成成分 。 碳酸鹽緩沖液是重要的體內(nèi)緩沖體系 ， 與 K＋ 、 Cl－ 等在維持酸堿平衡具有重要作用 。 6. 生長類因子及激素 細(xì)胞之間是相互聯(lián)系的 ， 而非孤立的 。 特別是高度分化功能的動物細(xì)胞更是如此 。 細(xì)胞離體生長時 ， 必要添加激素與細(xì)胞生長因子等 。 胰島素是最常用的激素 ， 促進(jìn)糖原和脂肪酸的合成 ， 對細(xì)胞的生長有刺激作用 。 其它激素有促卵泡激素 、 甲狀腺素 、 乳激素 、 生育酚等 。 細(xì)胞因子有表皮生長因子 、 成纖維細(xì)胞生長因子和神經(jīng)細(xì)胞生長因子 ， 根據(jù)不同細(xì)胞添加 。 為了細(xì)胞的貼壁生長 ， 必需添加貼附因子 ， 纖維結(jié)合蛋白 、膠原等 ， 伸展因子如表皮生長因子 、 成纖維細(xì)胞因子等 。 二 、 動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境需求 1. 水與滲透壓 細(xì)胞生長離不開水 ， 水是細(xì)胞反應(yīng)的重要介質(zhì) 。 1） 水是一種良好的溶媒 ， 營養(yǎng)物質(zhì)在水中被吸收 ， 廢物在水中被排泄 。 2） 具有熱穩(wěn)定性和導(dǎo)熱性 ， 調(diào)節(jié)穩(wěn)定溫度 。 正常血漿滲透壓主要是無機(jī)鹽 Na＋ 、 K＋ 、 Cl－ 、 HCO3－等構(gòu)成 ， 蛋白質(zhì)構(gòu)成膠體滲透壓較小 。 動物細(xì)胞對滲透壓有較強(qiáng)的耐受性 ， 常用增減 NaCl的濃度調(diào)整滲透壓 ， 每增加 1mg/ml NaCl， 滲透壓增加 32 mOsm/kg。 離體培養(yǎng)細(xì)胞的滲透壓應(yīng)控制為等滲透溶液 。 2. 溫度 不同種類的動物細(xì)胞對溫度的要求是不同的 ， 變溫動物對溫度要求沒有恒溫動物嚴(yán)格 。 哺乳動物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度為 37℃ ， 雞細(xì)胞為 39－ 40℃ ，而昆蟲類細(xì)胞為 25－ 28℃ 。 在培養(yǎng)過程中 ， 根據(jù)細(xì)胞種類選擇確定適宜的培養(yǎng)溫度 。 哺乳動物細(xì)胞的耐受溫度范圍較窄 ， 在 3537℃ 內(nèi)能正常進(jìn)行代謝和生長 ， 超出范圍會引起細(xì)胞傷害甚至死亡 。 細(xì)胞對低溫的耐受性比高溫要強(qiáng) ， 低溫抑制生長 ， 但無傷害作用 ， 在冰點(diǎn)溫度附近仍能存活 。 3. 氧氣 動物細(xì)胞生長必須有氧氣 ， 無氧下 ， 能獲得能量供應(yīng) ， 但細(xì)胞缺氧時不能生存 。 離體培養(yǎng)的氣體含有 5％ CO2和 95％ 空氣 ， 其中氧濃度為 21％ 。 有時充以 N2氣稀釋 O2濃度 。O2濃度在 60%以上為高氧環(huán)境 ， 對細(xì)胞毒性較大 。 4. pH值 動物細(xì)胞對 pH值很敏感 ， 低于 響 。 機(jī)體細(xì)胞的 pH范圍為 6－ 8， 血液和體液中 ， 變化范圍很小 。 人血液 pH維持 。 pH低于 中毒 ， 高于 。 細(xì)胞代謝產(chǎn)生 CO2， 使培養(yǎng)液變酸 ， pH發(fā)生波動 。 合成培養(yǎng)基偏酸性 ， 為了穩(wěn)定 pH，可用緩沖體系配制 。 在開放體系中 ， CO2逸出 ， 使培養(yǎng)基變堿 。 通入 5％ CO2， 可維持在 。 5. 生長基質(zhì) 改變生長表面特性 ， 促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì) 。 貼附細(xì)胞生長需要一個支持介質(zhì) ， 采用在培養(yǎng)液中添加或在器皿表面覆蓋生長基質(zhì) ， 幫助細(xì)胞的貼附和生長 。 生長基質(zhì)為胞外基質(zhì)成分 ， 多聚賴氨酸 、 纖維連接蛋白 、膠原 、 層黏蛋白 、 韌黏素等 。 生長基質(zhì)已有商業(yè)化產(chǎn)品 ， 用 PBS或 BBS配成 10倍貯存液 ，在 37℃ 下包被 ， 靜置 2－ 4小時或室溫過夜 ， 對器皿表面進(jìn)行包被 ， 然后無菌生理鹽水洗滌后使用 。 有些還可以直接加入培養(yǎng)液 。 生長基質(zhì) 貯存液濃度 使用濃度 使用方法 多聚賴氨酸 mg/L mg/L 表面包被 纖維連接蛋白 10 mg/ml 1 mg/ml 加入培養(yǎng)液 層粘蛋白 5～ 10 μg/ml 表面包被 韌粘素 75 μg/ml 5～ 15 μg/ml 包被或加入培養(yǎng)液 膠原蛋白 1～ 3 mg/ml mg/ml 表面包被 6． 抗生素 動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中 ， 由于培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富 ， 很容易被微生物污染 。 雖然對使用抗生素仍存在質(zhì)疑 ， 但還是常添加抗生素 ， 以避免輕度污染 。 抗生素使用濃度差別很大 ， 一般范圍為 50～ 100 μg/ml。在大規(guī)模生產(chǎn)中 ， 除了青霉素和 β內(nèi)酰胺類抗生素外 ，其它抗生素可以使用 。 抗生素使用對細(xì)胞會產(chǎn)生毒性 ， 而且使實(shí)驗(yàn)室保留抗藥性微生物 ， 應(yīng)加以注意和克服 。 抗生素 作用對象 工作濃度 （ μg/ml） 穩(wěn)定性 （ 天 ） 兩性霉素 B 真菌 1～ 3 制霉菌素 真菌 50 3 氨芐青霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 3 紅霉素 G＋ 細(xì)菌 ， 支原體 100 3 四環(huán)素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 ， 支原體 10 4 慶大霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 ， 支原體 50 5 利福平 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 50 3 卡那霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 5 鏈霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 3 氯霉素 G－ 細(xì)菌 5 5 青霉素 G G＋ 細(xì)菌 100 3 三 、 動物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類與組成 動物細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求高 ， 不同細(xì)胞系的要求也不盡相同 ， 因此培養(yǎng)基成分復(fù)雜而且昂貴 。 但是要盡可能提供與體內(nèi)生活條件接近的培養(yǎng)環(huán)境 。 主要組成成分如下： 糖類 、 必需氨基酸 、 維生素 、 無機(jī)鹽類 、 生長類因子及激素 、 結(jié)合蛋白質(zhì) 、 貼附與伸展因子及其它附加成分等 。 不同細(xì)胞對葡萄糖利用相似 ， 但對氨基酸的利用相差很大 ，不同的細(xì)胞過程對氨基酸的需求存在差別 。 目前停留在流加谷氨酰胺上 。 血清：蛋白質(zhì) 、 氨基酸 、 葡萄糖 、 激素和生長因子等 。胎牛血清 、 新生?；虺膳Ｑ?、 馬血清 、 雞血清 、 羊血清及人血清 ， 最廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和新生牛血清 。水解乳蛋白和膠原富含氨基酸 。 血清和水解酪蛋白應(yīng)用于許多細(xì)胞系和原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng) 。 脂類化合物對動物細(xì)胞培養(yǎng)是必需的 ， 實(shí)際中類脂及其前體和血清常平行使用 。 添加的蛋白質(zhì)試劑主要有鐵傳遞蛋白 ， 起離子載體的作用 ， 有時用無機(jī)鐵鹽代替 。 胰島素起生長素的作用 ， 白蛋白起保護(hù)劑作用 。 其他附加成分如核苷類及丙酮酸鹽等是培養(yǎng)基的必需成分 ， 有助于細(xì)胞克隆和特異化細(xì)胞的培養(yǎng) 。 動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中 ， 被微生物污染 。 常添加抗生素 ，以避免輕度污染 。 1. 天然培養(yǎng)基 直接取自于動物組織提取液或體液作為培養(yǎng)基 ， 如血漿凝塊 、 血清 、 淋巴液 、 胚胎浸出液等 。 營養(yǎng)價值高 ， 成分復(fù)雜 ， 不穩(wěn)定 ， 來源受到限制 ， 不宜大量培養(yǎng)和生產(chǎn)使用 。 2. 合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基 ， 組分穩(wěn)定 。 現(xiàn)在已有幾十種合成培養(yǎng)基 ， 大部分已商品化 。 組成：無機(jī)鹽 、 糖 、 氨基酸 、 維生素及其他成分 。 由于細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件不同 ， 所用合成培養(yǎng)基也不同 ，在動物細(xì)胞培養(yǎng)中最常用培養(yǎng)基有 7－ 8種 。 3. 無血清培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基是全部用已知成分組配的 、 不加血清的合成培養(yǎng)基 。 在含有營養(yǎng)和貼壁因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 ， 加入適宜的細(xì)胞生長因子 ， 細(xì)胞良好生長 ， 適合于制藥生產(chǎn) 。 無血清培養(yǎng)基提高了培養(yǎng)的質(zhì)量 ， 避免了使用血清帶來的麻煩 ， 產(chǎn)品純化容易 ， 組分穩(wěn)定 ， 可大量配制 。 無血清培養(yǎng)基通常需要添加激素與生長因子 、 結(jié)合蛋白 、貼壁與伸展因子 、 低分子營養(yǎng)成分等 。 大多數(shù)無血清培養(yǎng)基含有蛋白質(zhì)和激素等大分子物質(zhì) ， 適宜于多種細(xì)胞系的培養(yǎng) 。 對于大規(guī)模生產(chǎn)用的無血清培養(yǎng)基 ， 往往成分不完全清楚 ， 但簡單而且低成本 。 四 、 培養(yǎng)基的控制 1. 培養(yǎng)用水質(zhì) 細(xì)胞培養(yǎng)水質(zhì)最低要求電導(dǎo)率在 1X106Ω cm以上 。 水存放時間不宜超過 2周 。 對于制藥 ， 必需使用純凈水配制培養(yǎng)基 ， 普通水必需除去各類元素有毒或有害物質(zhì)及微生物 ， 還必需除熱源 ， 達(dá)到純凈水標(biāo)準(zhǔn) 。 2. 緩沖液 緩沖液：弱酸與弱酸鹽或弱堿與弱堿鹽組成的 ， pH恒定但不干擾試驗(yàn) 。 不同種類細(xì)胞對 pH 要求不一致 ， 不同生長階段對 pH要求也不同 。 原代細(xì)胞 pH要求嚴(yán)格 ， 而傳代細(xì)胞要求較寬 。 細(xì)胞培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì) ， 使培養(yǎng)基的 pH不斷下降 。 緩沖液中和培養(yǎng)液中的酸性物質(zhì) 。 最廣泛使用為碳酸氫鈉 /碳酸 ,其次為磷酸二氫鈉 /磷酸氫二鈉 ， 調(diào)節(jié)二者的比例 ， 配制成不同 pH緩沖液 。 碳酸鹽緩沖液除了直接的緩沖作用外 ， 還有間接作用 ， 碳酸生成揮發(fā)性 CO2后很快逸出 。 細(xì)胞呼吸產(chǎn)生的 CO2與水形成碳酸 ， 任何堿在培養(yǎng)液中都被中和 ， 生產(chǎn)相應(yīng)碳酸氫鹽 其他緩沖液 :TricineGlycine、 MOPS 、 TES 、 HEPES 、DIPSO 、 HEPPSO 等等有機(jī)緩沖液 ， 緩沖能力強(qiáng) 。 Tris所含氨基具有高的化學(xué)反應(yīng)活性 ， 能抑制細(xì)胞生長 ， 并通過生物膜 ， 它調(diào)節(jié) pH要依賴于溫度的變化 ， 因此不宜作為培養(yǎng)液 。 離體培養(yǎng)中 ， 緩沖液多為平衡鹽溶液的重要組分之一 ， 很少單純使用 。 3. 生理鹽水與平衡鹽溶液 在緩沖液的基礎(chǔ)上 ， 添加調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類 ， 在一定程度上能滿足細(xì)胞對 pH和鹽離子要求 。 緩沖液或緩沖鹽溶液用于 :配制溶液 , 處理細(xì)胞的溶液 。 對于直接接觸 、 長期培養(yǎng)的培養(yǎng)液 ， 常用生理鹽水和平衡鹽溶液 ， 是滲透壓與胞漿滲透壓平衡的溶液 。 生理鹽水供給細(xì)胞水分和各種離子 ， 維持一定滲透壓 ， 并能良好溶解試劑和藥物 。 有各種不同成分的生理鹽水 ， 分別加入 pH緩沖劑與指示劑 、 葡萄糖 ， 形成平衡鹽溶液 。 平衡鹽溶液：集緩沖液的緩沖能力 、 生理鹽水的等滲能力 、營養(yǎng)供給為一體 ， 具有多種功能和作用 。 BSS配制： 1） 先分別溶解 CaCl MgCl MgSO4。