【正文】 物細(xì)胞屬于貼壁依賴性 ， 貼壁培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一種重要方法 。 葡聚糖微載體：帶正電 ， 干粉可在 中吸脹 ， 清洗滅菌后使用 。 3. 懸浮培養(yǎng) 細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)過程 ,主要對(duì)于非貼壁性依賴性細(xì)胞 ， 如雜交瘤細(xì)胞等 。 雜交瘤細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合 ， 經(jīng)微囊發(fā)生器 ， 微球滴入氯化鈣溶液中 ， 形成凝膠 ， 然后用聚氨基酸處理 ， 使微球表面成膜 ， 再用檸檬酸去鈣離子 ， 球內(nèi)海藻酸鈉成液態(tài) ，細(xì)胞在在微囊內(nèi)懸浮 。 該方式操作簡(jiǎn)單 ， 使細(xì)胞密度和產(chǎn)量維持在較高水平 ， 能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行持續(xù)生產(chǎn) ， 反復(fù)收獲產(chǎn)物 ， 生產(chǎn)效率高 ，是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常被采用的方式 。 四 、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 （ 一 ） 轉(zhuǎn)瓶 最早的大規(guī)模培養(yǎng)的反應(yīng)器 。 (四 )流化床生物反應(yīng)器 細(xì)胞固定在多孔微載體中 ， 培養(yǎng)基以適當(dāng)?shù)牧魉僮韵露辖?jīng)過 ， 使多孔載體處于懸浮的流態(tài)的反應(yīng)器 。此時(shí)雖然細(xì)胞停止分裂 ， 但細(xì)胞的存活 、 健康和核形態(tài)不變 ， 代謝和分化功能仍可保持?jǐn)?shù)月 。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的核心參數(shù)是活細(xì)胞濃度 ， 可用細(xì)胞比生長(zhǎng)速率 （ μ） 、 比死亡速率 (Kd)和活細(xì)胞分?jǐn)?shù) (fv)來描述 ， 計(jì)算生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 。 3． 流加培養(yǎng) 流加體積對(duì)反應(yīng)器效率影響很大時(shí) ， Fo=0， 但 Fi≠0， 所以 V不是常數(shù) 。 只有在低稀釋速率時(shí)，死亡速率才重要。 對(duì)連續(xù)細(xì)胞系 ， 失去了細(xì)胞周期控制 ， 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分會(huì)影響細(xì)胞周期 。 1－ 3周后可占據(jù)所有的纖維空間 ， 并在纖維外壁表面上堆積成多層 ， 細(xì)胞密度可達(dá) 108/ml。 通過計(jì)算機(jī)控制混合氣體的組分 ， 維持培養(yǎng)基內(nèi)的容氧和 pH值 。 2） 利用培養(yǎng)基 ， 降低細(xì)胞代謝廢物 ， 細(xì)胞生長(zhǎng)良好 。 （ 三 ） 半連續(xù)式操作 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常采用 。 網(wǎng)格型為高分子凝膠細(xì)網(wǎng)格 ， 而微囊型為高分子半透膜 。 玻璃 、 聚苯乙烯塑料 、 不銹鋼金屬材料和微載體 、 多孔微載體或多孔微球 。 多孔微載體或多孔微球 ， 極大地增加了比表面積 ， 如Cytodex1的比表面積達(dá) 6000 cm2/g， Cytopore的比表面積達(dá) 28000 cm2/g。 在保護(hù)劑存在下 ， 慢凍快融是保存復(fù)蘇細(xì)胞的要領(lǐng) 。 二 、 工程細(xì)胞的獲得與保存 目前用于制藥的動(dòng)物細(xì)胞有 4類 ， 即原代細(xì)胞系 、 二倍體細(xì)胞系 、 異倍體細(xì)胞系和融合的或重組的工程細(xì)胞系 。 傳代細(xì)胞 : 原代細(xì)胞轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的細(xì)胞 。 對(duì)連續(xù)細(xì)胞系，失去了細(xì)胞周期控制，人工培養(yǎng)條件不適，細(xì)胞將發(fā)生程序化死亡即凋亡。 3） 在另一容器中用 % NaHCO3數(shù)滴溶解酚紅 。 原代細(xì)胞 pH要求嚴(yán)格 ， 而傳代細(xì)胞要求較寬 。 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高 ， 成分復(fù)雜 ， 不穩(wěn)定 ， 來源受到限制 ， 不宜大量培養(yǎng)和生產(chǎn)使用 。 抗生素 作用對(duì)象 工作濃度 （ μg/ml） 穩(wěn)定性 （ 天 ） 兩性霉素 B 真菌 1～ 3 制霉菌素 真菌 50 3 氨芐青霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 3 紅霉素 G＋ 細(xì)菌 ， 支原體 100 3 四環(huán)素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 ， 支原體 10 4 慶大霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 ， 支原體 50 5 利福平 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 50 3 卡那霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 5 鏈霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 3 氯霉素 G－ 細(xì)菌 5 5 青霉素 G G＋ 細(xì)菌 100 3 三 、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類與組成 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高 ， 不同細(xì)胞系的要求也不盡相同 ， 因此培養(yǎng)基成分復(fù)雜而且昂貴 。 人血液 pH維持 。 1） 水是一種良好的溶媒 ， 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在水中被吸收 ， 廢物在水中被排泄 。 維生素 K， 促進(jìn)合成凝血酶原 ， 促進(jìn)血液凝固 。 培養(yǎng)基中都必須添加葡萄糖 ， 有時(shí)添加核糖等 ?；?qū)胝婧思?xì)胞的方法很多 ， 主要有化學(xué)轉(zhuǎn)染 、 物理轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 。 NSO和 SP2/O－ Ag14不分泌 Ig， 與淋巴細(xì)胞融合篩選雜交瘤 ， 分泌制備特異性抗體 。 貼壁生長(zhǎng) ， 對(duì)很多病毒敏感 ， 廣泛用于疫苗生產(chǎn) 。 使篩選容易，而且能高效表達(dá)。 動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)制子， 在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。 如表達(dá)抗體的重鏈和輕鏈 ， 自主裝配成有功能的抗體 。 連續(xù)細(xì)胞系增加了生長(zhǎng)和代謝速率 ， 但同時(shí)導(dǎo)致了副產(chǎn)物的增加 。 IgG的糖基化 ， 等分 GlcNAc殘基連接在核心甘露糖上 ， 該糖基化在抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性中起重要作用 。 糖基化類型：寡糖基以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)的氮原子結(jié)合為 N糖基化 ， 或與氧原子結(jié)合為 O糖基化 。 葡萄糖代謝旺盛，會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。 細(xì)菌和酵母等產(chǎn)品要么是包涵體 ， 要么難以糖基化功能修飾 。 糖代謝特點(diǎn)： 動(dòng)物細(xì)胞吸收葡萄糖后，進(jìn)行糖酵解，大部分葡萄糖分解為丙酮酸，進(jìn)一步被還原為乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累。 3. 蛋白質(zhì)糖基化 蛋白質(zhì)合成是以 mRNA為模板 ， 在核糖體上完成 。 膽胺形成膜內(nèi)蛋白的橋 ， 而肌醇在膜內(nèi) 。 約有 70％ 批準(zhǔn)的蛋白質(zhì)藥物由哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)制造 ， 而且數(shù)目還在不斷增加 。 2） 易飼養(yǎng)：家蠶喪失了野外生存能力 ， 飼養(yǎng) ， 發(fā)育快 ， 3） 高量表達(dá)：用強(qiáng)啟動(dòng)子 ， 外源基因可超量表達(dá) 。 質(zhì)粒載體： 微生物的質(zhì)粒載體類似，一般是穿梭質(zhì)粒，具有兩個(gè)復(fù)制子和抗性篩選標(biāo)記基因。 雙順反子表達(dá)載體： 兩個(gè)基因在同一啟動(dòng)子控制之下，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)使同一 mRNA中的第二個(gè)基因得到翻譯。 外源基因的表達(dá)水平較高 ， 可用無血清培養(yǎng)基高密度培養(yǎng) ， 已成功地表達(dá)了 rhEPO、 rhGCSF、 tPA等 。 C127細(xì)胞系已表達(dá)多種外源基因 ， 其中 EPO的水平達(dá) 10 mg/L， 生產(chǎn) rhGH已被批準(zhǔn)上市 。 TN5B14：從粉紋夜蛾卵細(xì)胞勻漿中分離得到 ， 無血清培養(yǎng) ， 快速倍增 。 只能利用簡(jiǎn)單的單體化合物如單糖 、 氨基酸等 ， 為了維持細(xì)胞正常生長(zhǎng) ， 還必須添加維生素 、 無機(jī)鹽類 、生長(zhǎng)類因子及激素 、 結(jié)合蛋白質(zhì) 、 貼附與伸展因子及其它附加成分等 。 維生素 A維持正常視覺和上皮組織 。 細(xì)胞因子有表皮生長(zhǎng)因子 、 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ， 根據(jù)不同細(xì)胞添加 。O2濃度在 60%以上為高氧環(huán)境 ， 對(duì)細(xì)胞毒性較大 。 抗生素使用濃度差別很大 ， 一般范圍為 50～ 100 μg/ml。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中 ， 被微生物污染 。 對(duì)于制藥 ， 必需使用純凈水配制培養(yǎng)基 ， 普通水必需除去各類元素有毒或有害物質(zhì)及微生物 ， 還必需除熱源 ， 達(dá)到純凈水標(biāo)準(zhǔn) 。 平衡鹽溶液：集緩沖液的緩沖能力 、 生理鹽水的等滲能力 、營(yíng)養(yǎng)供給為一體 ， 具有多種功能和作用 。 第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過程 一、單細(xì)胞生長(zhǎng)增殖周期 從一個(gè)細(xì)胞分裂形成兩個(gè)新細(xì)胞的過程為一個(gè)細(xì)胞周期或一個(gè)細(xì)胞世代 。 體外培養(yǎng)細(xì)胞 ， 可分為原代細(xì)胞系 、 傳代細(xì)胞 。 血液 、 淋巴細(xì)胞 、 腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞屬于此類 ， 生長(zhǎng)干擾素的Namalwa細(xì)胞 。分裝 ， 火焰下封口 。 2． 微載體培養(yǎng) 微載體為三維培養(yǎng)系統(tǒng) ， 細(xì)胞貼附于微載體上伸展和增殖 ，再懸浮于培養(yǎng)液中 。 廣泛使用的多孔微載體有 Cellsnow、 Cytocell（纖維素基質(zhì)）、 Verax、 Cultisphere（膠原）、 Cytoline 1和 2（聚苯乙烯）、 ImmobaSil（硅橡膠）及 Siran（玻璃）等。 吸附：通過物理吸附使細(xì)胞貼附在固體載體表面 ， 微載體和中空纖維培養(yǎng)等 。 通過流加控制 ， 可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng) 。 灌流體系： 100％ 截留細(xì)胞 ， 如固定化包埋細(xì)胞 ， 可通過中空纖維 、 平板膜 、 凝膠顆粒和微囊等實(shí)現(xiàn)；部分截留細(xì)胞 ， 如使用微載體系統(tǒng) 、 貼壁系統(tǒng) 、 分離懸浮系統(tǒng)等實(shí)現(xiàn) ，其中分離懸浮系統(tǒng)包括使用膜過濾 、 旋轉(zhuǎn)過濾 、 離心 、 重力沉降等分離技術(shù) 。 噴射供氧 ， 氧傳遞速率高 ， 供氧良好 。 纖維管壁薄 ， 半透膜 ， 截留不同分子量 。 M期為有絲分裂期 ， 超螺旋化的染色單體 ， 經(jīng)過前期 、 中期 、 后期和末期 ， 被紡錘體拉向兩極 ， 中間形成細(xì)胞板 ，一個(gè)細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞 。 取樣對(duì)反應(yīng)器 V的 影響可忽略。高速攪拌時(shí) ， 細(xì)胞裂解也很嚴(yán)重 。在不進(jìn)料情況下，總細(xì)胞平衡： NVNFdtNVdapo ???? 0)(N：細(xì)胞總濃度， uap：表觀比生長(zhǎng)速率，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)和死亡。 醋酸纖維和聚甲基丙烯酸甲酯親水性弱 ， 極性大 ， 適宜于貼壁細(xì)胞培養(yǎng) 。 這種反應(yīng)器結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單 ， 傳質(zhì)性能好 ，采用膜氣體交換器 ， 能快速提供氧氣 。 （ 二 ） 攪拌罐反應(yīng)器 其結(jié)構(gòu)與微生物發(fā)酵罐相似 。 很難建立單一限制性基質(zhì)的衡化培養(yǎng) ， 需要多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流加 。 三 、 細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)的操作方式與微生物培養(yǎng)基本相同 。 常用的反應(yīng)器有通氣式攪拌混和氣升式生物反應(yīng)器 。 塑料載體 Biosilon是聚乙烯載體 ， 無吸附性能 ， 可重復(fù)使用 ， 但貼壁較慢 ， 對(duì)細(xì)胞的摩擦損傷較大 。 貼壁培養(yǎng)容器 :轉(zhuǎn)瓶 、 玻璃珠 、 微載體和中空纖維等 。 過程與原代細(xì)胞相同 ， 用 30－ 50倍體的 ％ 胰蛋白酶和 EDTA對(duì)細(xì)胞塊消化 ， 消化后再培養(yǎng) 。 如腫瘤細(xì)胞就是自發(fā)形成的永久細(xì)胞系 ， 沒有分裂次數(shù)的限制 。 三 、 群體細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 細(xì)胞分裂代數(shù) G就可用下列公式計(jì)算： G＝ logN－ logN0） /log2 第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 一、細(xì)胞的種類 生物體是由多種多樣的分化細(xì)胞構(gòu)成 ， 如人體的細(xì)胞類型達(dá) 200余種 。 注意事項(xiàng)： 細(xì)胞只利用 L型氨基酸 ， 不能利用 D型 ， 對(duì)于 DL混合型氨基酸 ， 使用量應(yīng)該加倍 。 離體培養(yǎng)中 ， 緩沖液多為平衡鹽溶液的重要組分之一 ， 很少單純使用 。 無血清培養(yǎng)基提高了培養(yǎng)的質(zhì)量 ， 避免了使用血清帶來的麻煩 ， 產(chǎn)品純化容易 ， 組分穩(wěn)定 ， 可大量配制 。水解乳蛋白和膠原富含氨基酸 。 貼附細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)支持介質(zhì) ， 采用在培養(yǎng)液中添加或在器皿表面覆蓋生長(zhǎng)基質(zhì) ， 幫助細(xì)胞的貼附和生長(zhǎng) 。 在培養(yǎng)過程中 ， 根據(jù)細(xì)胞種類選擇確定適宜的培養(yǎng)溫度 。 碳酸鹽緩沖液是重要的體內(nèi)緩沖體系 ， 與 K＋ 、 Cl－ 等在維持酸堿平衡具有重要作用 。 谷氨酰胺還可作為重要的碳源和能源而被利用 。 方法 表達(dá)類型 毒性 細(xì)胞類型 特點(diǎn) 磷酸鈣 瞬時(shí) 、穩(wěn)定 無 貼壁細(xì)胞 ，懸浮細(xì)胞 簡(jiǎn)單 DEAE葡聚糖 瞬時(shí) 有 CV1， COS 簡(jiǎn)單 陽(yáng)離子樹脂 瞬時(shí) 、穩(wěn)定 有或無 貼壁 、 原代懸浮細(xì)胞 簡(jiǎn)單 ， 有效 化學(xué)轉(zhuǎn)染的特點(diǎn) 四 、 轉(zhuǎn)染體篩選與分離 轉(zhuǎn)染后 1～ 6天收獲細(xì)胞 ， 進(jìn)行核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交 ， 檢測(cè)外源基因的瞬時(shí)表達(dá) 。 COS：是從 SV40 DNA轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞 CV1中分離得到的 ， 廣泛用于外源基因瞬時(shí)表達(dá)的研究 。 二氫葉酸還原酶缺陷株表達(dá)的藥物有 tPA、 EPO、HBsAg疫苗 、 GCSF、 凝血因子 Ⅷ 、 DNA酶 Ⅰ ， 已上市 。 基因的擴(kuò)增系統(tǒng)： 在逐漸提高選擇壓的情況下，使選擇標(biāo)記基因拷貝數(shù)增加，并可連帶其兩側(cè)序列一起擴(kuò)增，從而提高表達(dá)基因水平。 噬菌體 T7啟動(dòng)子比動(dòng)物基因啟動(dòng)子表達(dá)水平高 。 第二節(jié) 基因工程動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建 構(gòu)建高效表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞 篩選鑒定 獲得生產(chǎn)用工程化細(xì)胞系 動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體：病毒載體，質(zhì)粒載體。 苜蓿尺蠖核多角體病毒－秋黏蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) ， 家蠶核多角體病毒－家蠶幼蟲表達(dá)系統(tǒng) 。 細(xì)胞系 Fuc Gal 唾液酸 α1,6 α 1 , 3 Fuc α1 , 3Gal SO4 GalNAc α 2 ,3 α2,6 糖基