【正文】 效率較低 ，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他表達(dá)系統(tǒng) 。 連續(xù)細(xì)胞系增加了生長和代謝速率 ， 但同時導(dǎo)致了副產(chǎn)物的增加 。 培養(yǎng)基要求高 ， 需要添加氨基酸 、 維生素等 ， 往往需要附加血清 ， 提供生長因子 ， 費(fèi)用較高 。 表達(dá)載體的改進(jìn)和宿主細(xì)胞的改造是動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的研發(fā)重要內(nèi)容 。昆蟲病毒主要有桿狀病毒科核多角體病毒 。 Micro－ Gene Sys公司表達(dá)艾滋病基因工程疫苗 ， 隨后豬生長素 、 CD4膜蛋白及瘧疾疫苗 、 雞新城病毒疫苗 、 血吸蟲 GST疫苗 、 乙肝表面抗原 、 重組人 GM－ CSF等 。 生物試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品大多用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn) 。 優(yōu)點 1） 安全：桿狀病毒無致病性 ， 產(chǎn)品安全性受 FDA認(rèn)可 。 表達(dá)產(chǎn)物在昆蟲細(xì)胞內(nèi)能結(jié)晶 ， 對產(chǎn)物純化非常有意義 。 如表達(dá)抗體的重鏈和輕鏈 ， 自主裝配成有功能的抗體 。 缺點： 1） 重組率低 ， 篩選困難 ， 周期長 ， 需要 4－ 10天 。 3） 昆蟲細(xì)胞糖基化等加工途徑與哺乳動物細(xì)胞不完全相同 ， 它不提供復(fù)雜的 N糖基化 ， 如添加半乳糖和唾液酸殘基 ， 有可能造成溶解性 、 穩(wěn)定性 、 免疫性等變化 。 研究開發(fā)的主要方向：有效的病毒表達(dá)載體； 決定基因表達(dá)時期啟動子 ， 無血清培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞系 。 病毒載體： 逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒等載體，對原始病毒改造而來。 痘病毒載體可插入 25～ 40 kb外源基因，甚至是多個基因。 美國 Genentech公司已用 SV40載體生產(chǎn)乙肝疫苗，其他載體可用于基因治療。 大腸桿菌的復(fù)制子，細(xì)菌中繁殖。 動物細(xì)胞的復(fù)制子， 在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。 啟動子序列：含有 RNA聚合酶識別和結(jié)合位點 ， 以便有效轉(zhuǎn)錄 。 來源于病毒 、 動物基因和噬菌體的啟動子 。 動物基因的啟動子：轉(zhuǎn)錄因子 EF1α啟動子 、 泛素蛋白啟動子 、 β肌動蛋白啟動子 、 干擾素 α啟動子 、 IgG啟動子 、鼠金屬硫蛋白基因啟動子等 。 PolyA信號序列：保持 mRNA的穩(wěn)定性 ， 防止降解 ， 保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工和正確性 ， 但序列不宜太長 ， 避免能量過度消耗 。 牛生長素 （ BGH） 基因的 PolyA信號比 SV40 PolyA更強(qiáng) ，常用于高效表達(dá)載體中 。 在轉(zhuǎn)錄起始點上游或下游使用相同類型的增強(qiáng)子 ， 有利于提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平 。將 dhfr與目標(biāo)基因串連， dhfr的 cDNA插入內(nèi)含子中，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被剪切，翻譯不出蛋白質(zhì)，而目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物得到翻譯。 使篩選容易，而且能高效表達(dá)。 CMV啟動子和人 EF1α啟動子 ， 可實現(xiàn)同一載體上的二個基因的獨(dú)立表達(dá) 。 N端設(shè)計分泌信號肽：如 Ig κ鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)之間序列 ， 使外源基因的表達(dá)產(chǎn)物向胞外分泌 。 亞細(xì)胞定位信號肽：目標(biāo)基因產(chǎn)物將轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核 、 線粒體 、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞質(zhì)中 ， 這對基因的功能研究非常合適 。 最常用二氫葉酸二氫葉酸還原酶（ DHFR）基因系統(tǒng)和谷氨酰氨合成酶（ GS）基因系統(tǒng)。 硫胺蛋氨酸使 GS系統(tǒng)的基因得到大量擴(kuò)增。 表達(dá) IgM， 懸浮生長 。 英國 Welle公司用 Namalwa細(xì)胞的反應(yīng)器達(dá) 8000L， 用Sendai病毒誘導(dǎo) ， 大規(guī)模生產(chǎn) α干擾素 ， 并批準(zhǔn)上市 。 貼壁生長 ， 對很多病毒敏感 ， 廣泛用于疫苗生產(chǎn) 。 2． 哺乳動物細(xì)胞株系 CHO細(xì)胞：中國倉鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞系 ， 貼壁型生長 ， 是目前使用最為普遍和成熟的表達(dá)糖基化蛋白藥物的宿主細(xì)胞 。 貼壁型生長細(xì)胞 ， 但可進(jìn)行懸浮培養(yǎng) ，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力 。 有多種衍生突變株應(yīng)用于藥物的生產(chǎn) ， 培養(yǎng)時需要添加脯氨酸 。 使用氨甲酰喋呤 ， 增加外源基因的拷貝數(shù) ， 提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平 。 用于增殖病毒 、 制備疫苗和重組蛋白 。 C127：從小鼠乳腺腫瘤中分離獲得的上皮樣細(xì)胞 ， 貼壁型生長 。 3T3： HIN Swiss小鼠胚胎培養(yǎng)物中分離建立的連續(xù)細(xì)胞系，能大量表達(dá)外源蛋白，廣泛用于藥物毒理學(xué)研究。 NSO和 SP2/O－ Ag14不分泌 Ig， 與淋巴細(xì)胞融合篩選雜交瘤 ， 分泌制備特異性抗體 。 很多雜交瘤細(xì)胞系用于抗體的制備 。已有突變細(xì)胞系能用無血清培養(yǎng)。也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測。 GH3用于生長激素研究， 293細(xì)胞系用于基因治療的研究。 Sf9：從秋粘蟲的卵巢細(xì)胞 （ SF21） 中分離得到 ， 是最常用的昆蟲表達(dá)細(xì)胞 。 抗機(jī)械剪切 ， 能在無血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器中生長 。 分泌表達(dá)重組蛋白的能力比 Sf9細(xì)胞系高 20多倍 ， 能適應(yīng)懸浮培養(yǎng) 。基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法很多 ， 主要有化學(xué)轉(zhuǎn)染 、 物理轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 。 其基本原理是磷酸鈣、二乙氨乙基（ DEAE）－葡聚糖（ dextran）和陽離子樹脂與核酸形成復(fù)合物，附著于細(xì)胞表面，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。 滲透性休克和 DMSO等化學(xué)試劑能促進(jìn) DNA進(jìn)入細(xì)胞。 影響因素：細(xì)胞培養(yǎng)物的密度、 DNA的大小、純度與用量、化學(xué)試劑的用量與處理時間、促進(jìn)劑的使用等。 為了獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞系 ， 先在非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24～ 48小時 ， 讓細(xì)胞倍增 1～ 2代 ， 使轉(zhuǎn)染 DNA表達(dá) 。 在轉(zhuǎn)染中大約有萬分之一的細(xì)胞將穩(wěn)定整合外源基因，因此需要顯性選擇標(biāo)記來分離轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 選擇劑 基因 使用濃度 氨甲喋呤 dhfr－ ～ 300 μmol/L 氨喋呤 tk＋ μmol/L 5溴脫氧尿苷 tk－ 30 μg/ml G418, Zeocin neo 100～ 800 μg/ml 潮霉素 B hyg 10～ 400 μg/ml 殺瘟稻菌素 bsd 2～ 10 μg/ml 霉酚酸 gpt 25 μg/ml 嘌呤霉素 乙?；D(zhuǎn)移酶 ～ 10 μg/ml XylA ada 4 μmol/L 報告基因 特點 使用與分析方法 cat 內(nèi)源活性低 ， 蛋白穩(wěn)定 ， 線性范圍窄 ， 體外 ， 熒光或免疫分析 lacZ 有內(nèi)源活性 ， Xgal染色 ， 線性范圍寬 體內(nèi)外 ， 染色 ， 比色 、化學(xué)發(fā)光或熒光分析 堿性磷酸酶 分泌型 ， 線性范圍寬 ，受到細(xì)胞類型限制 體外 ， 比色 、 化學(xué)發(fā)光或熒光分析 gus 蛋白質(zhì)穩(wěn)定 ， 線性范圍寬 ， XGluc染色 體內(nèi)外 ， 染色 ， 比色 、化學(xué)發(fā)光或熒光分析 gfp 無內(nèi)源活性 ， 分子量小 ，穩(wěn)定 ， 無需底物 ， 紫外線激發(fā) 體內(nèi)外 ， 熒光分析 第三節(jié) 動物細(xì)胞培養(yǎng)的需求與培養(yǎng)基的制備 動物細(xì)胞離體后 ， 失去了消化等系統(tǒng) ， 不能利用多糖 、蛋白質(zhì)等聚合程度高的化合物 。 動物細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境的要求高 ， 不同細(xì)胞系的要求也不盡相同 ， 培養(yǎng)基要盡可能與體內(nèi)生活條件接近 。 培養(yǎng)基中都必須添加葡萄糖 ， 有時添加核糖等 。 2. 氨基酸 氨基酸是蛋白質(zhì)和酶的組成單位 。 氨基酸可通過生糖或生酮途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑舅?， 間接提供能量 。 離體容易失去 ， 20種氨基酸中至少 12種是必需氨基酸： 精氨酸 、 半胱氨酸 、 組氨酸 、 異亮氨酸 、 亮氨酸 、 賴氨酸 、蛋氨酸 、 苯丙氨酸 、 蘇氨酸 、 色氨酸 、 酪氨酸 、 纈氨酸等 。 3. 維生素 維生素是一類微量的小分子有機(jī)生物活性物質(zhì) ， 對代謝和生長起調(diào)節(jié)和控制作用 。 B族維生素以輔酶或輔基形式參與酶反應(yīng) ， 主要調(diào)節(jié)酶活性和代謝活性 。 脂溶性維生素包括維生素 A、 D、 E、 K四種 。 維生素 D為視固醇類化合物 ， 主要是調(diào)節(jié)鈣磷代謝 。 維生素 K， 促進(jìn)合成凝血酶原 ， 促進(jìn)血液凝固 。 Na＋ 和 Cl－ 參與生理電活動 ， 維持水平衡 、 保持滲透壓和酸堿平衡 。 Ca2＋ 、 Mg2＋ ， 對細(xì)胞間的互黏穩(wěn)定起重要作用 。 磷是核酸 、 磷脂等的組成成分 。 6. 生長類因子及激素 細(xì)胞之間是相互聯(lián)系的 ， 而非孤立的 。 細(xì)胞離體生長時 ， 必要添加激素與細(xì)胞生長因子等 。 其它激素有促卵泡激素 、 甲狀腺素 、 乳激素 、 生育酚等 。 為了細(xì)胞的貼壁生長 ， 必需添加貼附因子 ， 纖維結(jié)合蛋白 、膠原等 ， 伸展因子如表皮生長因子 、 成纖維細(xì)胞因子等 。 1） 水是一種良好的溶媒 ， 營養(yǎng)物質(zhì)在水中被吸收 ， 廢物在水中被排泄 。 正常血漿滲透壓主要是無機(jī)鹽 Na＋ 、 K＋ 、 Cl－ 、 HCO3－等構(gòu)成 ， 蛋白質(zhì)構(gòu)成膠體滲透壓較小 。 離體培養(yǎng)細(xì)胞的滲透壓應(yīng)控制為等滲透溶液 。 哺乳動物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度為 37℃ ， 雞細(xì)胞為 39－ 40℃ ，而昆蟲類細(xì)胞為 25－ 28℃ 。 哺乳動物細(xì)胞的耐受溫度范圍較窄 ， 在 3537℃ 內(nèi)能正常進(jìn)行代謝和生長 ， 超出范圍會引起細(xì)胞傷害甚至死亡 。 3. 氧氣 動物細(xì)胞生長必須有氧氣 ， 無氧下 ， 能獲得能量供應(yīng) ， 但細(xì)胞缺氧時不能生存 。 有時充以 N2氣稀釋 O2濃度 。 4. pH值 動物細(xì)胞對 pH值很敏感 ， 低于 響 。 人血液 pH維持 。 細(xì)胞代謝產(chǎn)生 CO2， 使培養(yǎng)液變酸 ， pH發(fā)生波動 。 在開放體系中 ， CO2逸出 ， 使培養(yǎng)基變堿 。 5. 生長基質(zhì) 改變生長表面特性 ， 促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì) 。 生長基質(zhì)為胞外基質(zhì)成分 ， 多聚賴氨酸 、 纖維連接蛋白 、膠原 、 層黏蛋白 、 韌黏素等 。 有些還可以直接加入培養(yǎng)液 。 雖然對使用抗生素仍存在質(zhì)疑 ， 但還是常添加抗生素 ， 以避免輕度污染 。在大規(guī)模生產(chǎn)中 ， 除了青霉素和 β內(nèi)酰胺類抗生素外 ，其它抗生素可以使用 。 抗生素 作用對象 工作濃度 （ μg/ml） 穩(wěn)定性 （ 天 ） 兩性霉素 B 真菌 1～ 3 制霉菌素 真菌 50 3 氨芐青霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 3 紅霉素 G＋ 細(xì)菌 ， 支原體 100 3 四環(huán)素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 ， 支原體 10 4 慶大霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 ， 支原體 50 5 利福平 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 50 3 卡那霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 5 鏈霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 3 氯霉素 G－ 細(xì)菌 5 5 青霉素 G G＋ 細(xì)菌 100 3 三 、 動物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類與組成 動物細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求高 ， 不同細(xì)胞系的要求也不盡相同 ， 因此培養(yǎng)基成分復(fù)雜而且昂貴 。 主要組成成分如下： 糖類 、 必需氨基酸 、 維生素 、 無機(jī)鹽類 、 生長類因子及激素 、 結(jié)合蛋白質(zhì) 、 貼附與伸展因子及其它附加成分等 。 目前停留在流加谷氨酰胺上 。胎牛血清 、 新生?；虺膳Ｑ?、 馬血清 、 雞血清 、 羊血清及人血清 ， 最廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和新生牛血清 。 血清和水解酪蛋白應(yīng)用于許多細(xì)胞系和原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng) 。 添加的蛋白質(zhì)試劑主要有鐵傳遞蛋白 ， 起離子載體的作用 ， 有時用無機(jī)鐵鹽代替 。 其他附加成分如核苷類及丙酮酸鹽等是培養(yǎng)基的必需成分 ， 有助于細(xì)胞克隆和特異化細(xì)胞的培養(yǎng) 。 常添加抗生素 ，以避免輕度污染 。 營養(yǎng)價值高 ， 成分復(fù)雜 ， 不穩(wěn)定 ， 來源受到限制 ， 不宜大量培養(yǎng)和生產(chǎn)使用 。 現(xiàn)在已有幾十種合成培養(yǎng)基 ， 大部分已商品化 。 由于細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件不同 ， 所用合成培養(yǎng)基也不同 ，在動物細(xì)胞培養(yǎng)中最常用培養(yǎng)基有 7－ 8種 。 在含有營養(yǎng)和貼壁因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 ， 加入適宜的細(xì)胞生長因子 ， 細(xì)胞良好生長 ， 適合于制藥生產(chǎn) 。 無血清培養(yǎng)基通常需要添加激素與生長因子 、 結(jié)合蛋白 、貼壁與伸展因子 、 低分子營養(yǎng)成分等 。 對于大規(guī)模生產(chǎn)用的無血清培養(yǎng)基 ， 往往成分不完全清楚 ， 但簡單而且低成本 。 水存放時間不宜超過 2周 。 2. 緩沖液 緩沖液：弱酸與弱酸鹽或弱堿與弱堿鹽組成的 ， pH恒定但不干擾試驗 。 原代細(xì)胞 pH要求嚴(yán)格 ， 而傳代細(xì)胞要求較寬 。 緩沖液中和培養(yǎng)液中的酸性物質(zhì) 。 碳酸鹽緩沖液除了直接的緩沖作用外 ， 還有間接作用 ， 碳酸生成揮發(fā)性 CO2后很