【正文】 生素 、 葡萄糖 、 緩沖液等 、 補充因子幾類 ， 先配制成高倍濃縮的母液 ， 過濾滅菌 ， 冷藏 。 NaHCO3一般配成 ％ 、 %、 %三種濃度 ， 過濾除菌或高壓滅菌 ， 4度保存 ， 使用前加入 ， 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH。 注意事項： 細胞只利用 L型氨基酸 ， 不能利用 D型 ， 對于 DL混合型氨基酸 ， 使用量應(yīng)該加倍 。小量培養(yǎng)液可置 4度保存 。 6） 補足水 ， 并用 NaHCO3調(diào)節(jié) pH。 4） 將含 Ca2+、 Mg2+溶液緩慢倒入步驟 2配制的溶液中 ， 攪拌 ， 防止沉淀 。 2） 在另一容器中依次溶解其他試劑 。 平衡鹽溶液：集緩沖液的緩沖能力 、 生理鹽水的等滲能力 、營養(yǎng)供給為一體 ， 具有多種功能和作用 。 生理鹽水供給細胞水分和各種離子 ， 維持一定滲透壓 ， 并能良好溶解試劑和藥物 。 緩沖液或緩沖鹽溶液用于 :配制溶液 , 處理細胞的溶液 。 離體培養(yǎng)中 ， 緩沖液多為平衡鹽溶液的重要組分之一 ， 很少單純使用 。 細胞呼吸產(chǎn)生的 CO2與水形成碳酸 ， 任何堿在培養(yǎng)液中都被中和 ， 生產(chǎn)相應(yīng)碳酸氫鹽 其他緩沖液 :TricineGlycine、 MOPS 、 TES 、 HEPES 、DIPSO 、 HEPPSO 等等有機緩沖液 ， 緩沖能力強 。 最廣泛使用為碳酸氫鈉 /碳酸 ,其次為磷酸二氫鈉 /磷酸氫二鈉 ， 調(diào)節(jié)二者的比例 ， 配制成不同 pH緩沖液 。 細胞培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì) ， 使培養(yǎng)基的 pH不斷下降 。 不同種類細胞對 pH 要求不一致 ， 不同生長階段對 pH要求也不同 。 對于制藥 ， 必需使用純凈水配制培養(yǎng)基 ， 普通水必需除去各類元素有毒或有害物質(zhì)及微生物 ， 還必需除熱源 ， 達到純凈水標準 。 四 、 培養(yǎng)基的控制 1. 培養(yǎng)用水質(zhì) 細胞培養(yǎng)水質(zhì)最低要求電導(dǎo)率在 1X106Ω cm以上 。 大多數(shù)無血清培養(yǎng)基含有蛋白質(zhì)和激素等大分子物質(zhì) ， 適宜于多種細胞系的培養(yǎng) 。 無血清培養(yǎng)基提高了培養(yǎng)的質(zhì)量 ， 避免了使用血清帶來的麻煩 ， 產(chǎn)品純化容易 ， 組分穩(wěn)定 ， 可大量配制 。 3. 無血清培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基是全部用已知成分組配的 、 不加血清的合成培養(yǎng)基 。 組成：無機鹽 、 糖 、 氨基酸 、 維生素及其他成分 。 2. 合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基 ， 組分穩(wěn)定 。 1. 天然培養(yǎng)基 直接取自于動物組織提取液或體液作為培養(yǎng)基 ， 如血漿凝塊 、 血清 、 淋巴液 、 胚胎浸出液等 。 動物細胞培養(yǎng)過程中 ， 被微生物污染 。 胰島素起生長素的作用 ， 白蛋白起保護劑作用 。 脂類化合物對動物細胞培養(yǎng)是必需的 ， 實際中類脂及其前體和血清常平行使用 。水解乳蛋白和膠原富含氨基酸 。 血清：蛋白質(zhì) 、 氨基酸 、 葡萄糖 、 激素和生長因子等 。 不同細胞對葡萄糖利用相似 ， 但對氨基酸的利用相差很大 ，不同的細胞過程對氨基酸的需求存在差別 。 但是要盡可能提供與體內(nèi)生活條件接近的培養(yǎng)環(huán)境 。 抗生素使用對細胞會產(chǎn)生毒性 ， 而且使實驗室保留抗藥性微生物 ， 應(yīng)加以注意和克服 。 抗生素使用濃度差別很大 ， 一般范圍為 50～ 100 μg/ml。 生長基質(zhì) 貯存液濃度 使用濃度 使用方法 多聚賴氨酸 mg/L mg/L 表面包被 纖維連接蛋白 10 mg/ml 1 mg/ml 加入培養(yǎng)液 層粘蛋白 5～ 10 μg/ml 表面包被 韌粘素 75 μg/ml 5～ 15 μg/ml 包被或加入培養(yǎng)液 膠原蛋白 1～ 3 mg/ml mg/ml 表面包被 6． 抗生素 動物細胞培養(yǎng)過程中 ， 由于培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富 ， 很容易被微生物污染 。 生長基質(zhì)已有商業(yè)化產(chǎn)品 ， 用 PBS或 BBS配成 10倍貯存液 ，在 37℃ 下包被 ， 靜置 2－ 4小時或室溫過夜 ， 對器皿表面進行包被 ， 然后無菌生理鹽水洗滌后使用 。 貼附細胞生長需要一個支持介質(zhì) ， 采用在培養(yǎng)液中添加或在器皿表面覆蓋生長基質(zhì) ， 幫助細胞的貼附和生長 。 通入 5％ CO2， 可維持在 。 合成培養(yǎng)基偏酸性 ， 為了穩(wěn)定 pH，可用緩沖體系配制 。 pH低于 中毒 ， 高于 。 機體細胞的 pH范圍為 6－ 8， 血液和體液中 ， 變化范圍很小 。O2濃度在 60%以上為高氧環(huán)境 ， 對細胞毒性較大 。 離體培養(yǎng)的氣體含有 5％ CO2和 95％ 空氣 ， 其中氧濃度為 21％ 。 細胞對低溫的耐受性比高溫要強 ， 低溫抑制生長 ， 但無傷害作用 ， 在冰點溫度附近仍能存活 。 在培養(yǎng)過程中 ， 根據(jù)細胞種類選擇確定適宜的培養(yǎng)溫度 。 2. 溫度 不同種類的動物細胞對溫度的要求是不同的 ， 變溫動物對溫度要求沒有恒溫動物嚴格 。 動物細胞對滲透壓有較強的耐受性 ， 常用增減 NaCl的濃度調(diào)整滲透壓 ， 每增加 1mg/ml NaCl， 滲透壓增加 32 mOsm/kg。 2） 具有熱穩(wěn)定性和導(dǎo)熱性 ， 調(diào)節(jié)穩(wěn)定溫度 。 二 、 動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境需求 1. 水與滲透壓 細胞生長離不開水 ， 水是細胞反應(yīng)的重要介質(zhì) 。 細胞因子有表皮生長因子 、 成纖維細胞生長因子和神經(jīng)細胞生長因子 ， 根據(jù)不同細胞添加 。 胰島素是最常用的激素 ， 促進糖原和脂肪酸的合成 ， 對細胞的生長有刺激作用 。 特別是高度分化功能的動物細胞更是如此 。 碳酸鹽緩沖液是重要的體內(nèi)緩沖體系 ， 與 K＋ 、 Cl－ 等在維持酸堿平衡具有重要作用 。 在離體培養(yǎng)時 ， 螯合細胞間的 Ca2＋ 和 Mg2＋ ， 可以達到分散細胞的目的 。 離體培養(yǎng)為細胞提供足夠的 Na和 Cl離子是基本條件 ， 一般生理鹽水的離子濃度 （ % NaCl） 。 5. 無機鹽類 無機鹽是細胞代謝所需的酶的輔基 ， 同時保持細胞的滲透壓和緩沖 pH的變化 。 維生素 E即生育酚 ， 是抗氧化劑 ， 防止生物膜中磷脂的不飽和脂肪酸被氧化 。 維生素 A維持正常視覺和上皮組織 。維生素 C， 抗壞血酸 ， 在體內(nèi)參與還原反應(yīng) 、 羥化反應(yīng) ，促進膠原蛋白合成和粘多糖合成 ， 抗氧化作用 。 水溶性維生素包括 B族維生素和維生素 C。 谷氨酰胺還可作為重要的碳源和能源而被利用 。 動物細胞： 8－ 10種必須氨基酸 。 氨基酸還參與合成一些含氮化合物 ， 核苷酸的四種嘌呤和嘧啶堿基 、 兒茶酚胺等含氮激素及神經(jīng)遞質(zhì)等 。 提高細胞生長的碳源和能源 ， 主要是葡萄糖和谷氨酰胺 。 一 、 動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求 糖類是細胞主要的營養(yǎng)物質(zhì) ， 分解后釋放出能量 ATP。 只能利用簡單的單體化合物如單糖 、 氨基酸等 ， 為了維持細胞正常生長 ， 還必須添加維生素 、 無機鹽類 、生長類因子及激素 、 結(jié)合蛋白質(zhì) 、 貼附與伸展因子及其它附加成分等 。 哺乳動物細胞的選擇標記，使用與之相對應(yīng)的選擇劑。再按 1： 15比例轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上 ， 每 2～ 4天更換培養(yǎng)基 ， 持續(xù) 2～ 3周 ， 促進抗性細胞生長 ， 清除死細胞殘骸 ， 最后得到獨立的克隆 。 方法 表達類型 毒性 細胞類型 特點 磷酸鈣 瞬時 、穩(wěn)定 無 貼壁細胞 ，懸浮細胞 簡單 DEAE葡聚糖 瞬時 有 CV1， COS 簡單 陽離子樹脂 瞬時 、穩(wěn)定 有或無 貼壁 、 原代懸浮細胞 簡單 ， 有效 化學(xué)轉(zhuǎn)染的特點 四 、 轉(zhuǎn)染體篩選與分離 轉(zhuǎn)染后 1～ 6天收獲細胞 ， 進行核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交 ， 檢測外源基因的瞬時表達 。轉(zhuǎn)染試劑盒商業(yè)化供應(yīng)，特別是脂質(zhì)體材料的轉(zhuǎn)染試劑。 磷酸鈣與 DNA形成不溶性沉淀，帶正電荷的 DEAE－葡聚糖與帶負電荷的 DNA磷酸基團結(jié)合，陽離子樹脂包裹DNA形成脂質(zhì)體。 方法 表達類型 毒性 細胞類型 特點 基因槍 瞬時 ，穩(wěn)定 無 多種細胞組織 ， 器官 有效 ， 儀器操作 顯微注射 瞬時 ，穩(wěn)定 無 多種細胞 有效 ， 技術(shù)難度大 電穿孔 瞬時 ，穩(wěn)定 無 多種細胞 有效 ， 儀器操作 沖擊波 瞬時 ，穩(wěn)定 無 多種細胞 ，局部組織 簡單有效 ，儀器操作 方法 表達類型 毒性 細胞類型 特點 逆轉(zhuǎn)錄病毒 瞬時 ，穩(wěn)定 無 對應(yīng)的宿主細胞 有效 原生質(zhì)體融合 瞬時 ，穩(wěn)定 無 懸浮細胞 技術(shù)復(fù)雜 生物轉(zhuǎn)染特點 化學(xué)轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法。 三 、 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染 （ 是將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎募夹g(shù)通用名稱 。 TN5B14：從粉紋夜蛾卵細胞勻漿中分離得到 ， 無血清培養(yǎng) ， 快速倍增 。 對桿狀病毒高度敏感 ， 生長快 ， 能高效表達外源基因 。 3． 昆蟲細胞株系 Sf21：從秋粘蟲卵巢細胞中分離得到 ， 細胞較大 ， 容易放大 ， 高效表達外源基因 。 COS：是從 SV40 DNA轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細胞 CV1中分離得到的 ， 廣泛用于外源基因瞬時表達的研究 。最為常用 Vero E6增殖多種病毒，如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產(chǎn)病毒性疫苗，已被批準用于人體。 Vero：從成年非洲綠猴腎中分離獲得的貼壁型成纖維細胞，多倍體核型，能適應(yīng)灌流操作，進行連續(xù)培養(yǎng)。 雜交瘤細胞：從小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞的融合細胞中分離獲得雜交瘤細胞系 ， 能在無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長 ， 容易轉(zhuǎn)染和生長 ， 能進行糖基化等加工修飾 ， 大量分泌和高效表達 。 骨髓瘤細胞： J558L是小鼠 BALB/c骨髓瘤細胞 ， 分泌 IgA，用于轉(zhuǎn)染研究 。 C127細胞系已表達多種外源基因 ， 其中 EPO的水平達 10 mg/L， 生產(chǎn) rhGH已被批準上市 。 BHK21表達的重組凝血因子 Ⅷ 已被獲準上市 。 BHK－ 21：幼倉鼠腎臟中分離的成纖維樣細胞 ， 非整倍體 。 二氫葉酸還原酶缺陷株表達的藥物有 tPA、 EPO、HBsAg疫苗 、 GCSF、 凝血因子 Ⅷ 、 DNA酶 Ⅰ ， 已上市 。 蛋白質(zhì)翻譯后的修飾準確 ， 表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu) 、 性質(zhì)和生物活性接近天然 。 核型為亞二倍體 ， 分泌表達外源蛋白 ， 而內(nèi)源蛋白分泌很少 。 MRC5：二倍體成纖維細胞系 ， 但生長較 WI38快 ， 對逆境有一定抗性也用于制備疫苗 。 WI38：二倍體成纖維細胞系 ， 2n=46， 第一個被用于制備疫苗 。 外源基因的表達水平較高 ， 可用無血清培養(yǎng)基高密度培養(yǎng) ， 已成功地表達了 rhEPO、 rhGCSF、 tPA等 。 二 、 受體細胞 1． 人源細胞株系 Namalwa：類淋巴母細胞 ， 非整體核型 。 氨甲喋呤基因與目標基因重組，氨甲喋呤使 dhfr基因與目標基因大量增加，達到數(shù)千拷貝。 基因的擴增系統(tǒng)： 在逐漸提高選擇壓的情況下，使選擇標記基因拷貝數(shù)增加，并可連帶其兩側(cè)序列一起擴增，從而提高表達基因水平。 C端設(shè)計跨膜錨定序列：可使外源蛋白展示在細胞表面 。 組織特異性啟動子：如鼠 、 山羊酪蛋白啟動子 ， 可使基因主要在乳腺中表達 。 選擇適宜的啟動子 ， 可實現(xiàn)定向表達 。 順反子在多亞基蛋白的偶聯(lián)表達及其控制策略等方面有廣泛應(yīng)用前景。 雙順反子表達載體： 兩個基因在同一啟動子控制之下，內(nèi)部核糖體進入位點使同一 mRNA中的第二個基因得到翻譯。 終止序列： AAUAAA或連續(xù)的終止密碼 UGA、 UAA和UAG， 能防止轉(zhuǎn)錄通讀 ， 使轉(zhuǎn)錄在正確的位點結(jié)束 。 添加 PolyA信號和 5′端轉(zhuǎn)錄暫停位點 ， 可以減少上游序列轉(zhuǎn)錄通讀造成的背景 。 噬菌體 T7啟動子比動物基因啟動子表達水平高 。 動 物 病 毒 啟 動 子 ： 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 的 長 末 端 重 復(fù) 序 列（ LTRS） 、 SV40病毒的早期和晚期啟動子 、 腺病毒的晚期啟動子 、 人巨噬病毒 （ CMV） 立即早期基因啟動子 。 TATA盒 ， 確定起始位置； GG盒 ， 影響轉(zhuǎn)錄頻率 。 還有絲狀噬菌體復(fù)制子。 抗生素